非靶向代謝組技術研究飲料發酵前后物質變化

張妍，趙昕琪，王天琪，王成，于冰，呂佳璐，張莉力，許云賀

(錦州醫科大學 食品科學與工程學院，遼寧 錦州，121000)

隨著人們生活水平的提高，乳酸菌飲料受到了人們的關注。乳酸菌具有改善腸道菌群，降低膽固醇，增強人體免疫力的功效。乳酸菌發酵能改善食品的品質、風味。目前，市場上大多數乳酸菌飲料是以牛奶為基質，但隨著乳糖不耐受人群的出現和素食主義者的增加，牛奶基質的乳酸菌飲料已不能滿足市場需求。

乳酸菌發酵可以產生許多活性物質，其益生功能已經成為食品以及臨床醫學等領域研究的熱點。微生物可以將原料經特定的代謝途徑轉化為易于人體吸收、利用的物質。微生物生長代謝過程中激活活性成分，從而產生新的功效，提高營養價值，促進機體的吸收和利用。玉米作為中國重要的糧食作物之一，主要用于淀粉的提取，玉米須、玉米皮很少被開發利用。隨著科技的進步及產業化條件的成熟，玉米副產物的開發前景十分可觀。玉米須和玉米皮有降血壓、降血脂和降血糖等功效；玉米及其副產物發酵飲料作為玉米精深加工技術的一種應用，采用微生物發酵和飲料加工技術，保留了原料自身天然活性物質的同時，降低原料中淀粉、蛋白質、不溶性纖維等大分子物質，提高了飲料口感和穩定性，是玉米及其副產物研發的新方向。

為了解玉米及其副產物發酵飲料的主要代謝成分，代謝通路及物質積累的變化，本實驗以2種乳酸菌為發酵劑混合發酵的玉米及其副產物飲料為研究對象，利用非靶向代謝組技術對飲料發酵前后小分子量物質變化進行了對比分析，將比較得到的顯著性差異代謝物進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路富集分析。探究LactobacillusparacaseiL1和LactobacilluscaseiYQ336代謝特征及加工學原理，以期為玉米副產物發酵飲料加工工藝改良，滋味品質提升和功能性成分富集等方面研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.paracaseiL1、L.caseiYQ336于錦州醫科大學食品科學與工程學院微生物實驗室保存，該菌株已保藏到中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC4163)[1]。

玉米粒、鮮胡蘿卜、玉米須、玉米皮等為原料，經煮制，打碎，過濾，調配和滅菌工藝處理得到發酵前玉米副產物飲料(B組)，在發酵前的玉米副產物飲料中接種L.paracaseiL1和L.caseiYQ336，37 ℃發酵15 h后得到玉米副產物發酵飲料(A組)。

Triple TOF 5600+質譜儀，美國AB SCIEX公司；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(Agilent)，美國安捷倫公司；ACQUITY BEH C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) ，上海希言科學儀器有限公司；乙腈、乙酸銨、甲醇、氨水 均為色譜純，美國BCL公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品信息

檢測樣本見表1。共2組待測樣本，每組6個平行，同時制備了控制樣本(quality control，QC)，用來平衡色譜-質譜系統及測定儀器狀態，評價系統的穩定性[2]。

表1 樣品信息

1.2.2 代謝物提取

取樣品于4 ℃解凍，冷凍干燥后加入200 μL預冷水和800 μL預冷的V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1混合溶液，混勻，-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白，16 000×g、4 ℃ 離心20 min，取上清液。上清液在高速真空濃縮離心機揮干。質譜檢測時加入100 μL的V(乙腈)∶V(水)=1∶1混合溶液進行復溶，16 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液進樣分析[3]。

1.2.3 色譜分離

將樣品放在4 ℃進樣器中自動進樣，采用Agilent1 290 Infinity LC超高效液相色譜系統(ultra high performance liquid chromatography，UHPLC)，HILIC色譜柱對樣品進行分離。進樣量5 μL，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序見表2[4]。

表2 梯度洗脫表

1.2.4 質譜采集

采用電噴霧電離對各個樣品進行正負離子模式檢測。樣品經UHPLC分離再用Triple-TOF 5600質譜儀進行質譜分析。ESI源條件如下：離子源氣體1，60 psi；離子源氣體2，60 psi；氣簾氣壓力，30 psi；源溫度 600 ℃；m/z掃描范圍：60～1 200 u；產物離子掃描m/z范圍：25～1 000 u；掃描累積時間 0.15 s/光譜；產物離子掃描累積時間0.03 s/光譜。二級質譜采用依賴型掃描采集獲得，并且采用高靈敏度模式，去簇電壓±60 V(正負兩種模式)，碰撞能量30 eV[5]。

1.3 統計分析

數據利用MSDIAL采集，再用程序XCMS進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。比對HMDB、MassBank 等公共數據庫。根據提取的物質含量進行篩選鑒定。使用SIMCA-P 14.1處理數據，經Pareto scaling預處理后，進行主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)等多元統計分析[6]。

2 結果與分析

2.1 飲料發酵前后色譜圖

所有飲料樣本均在UHPLC-MS平臺上分析,對QC樣本正、負離子質譜總離子流圖(total ion current，TIC)進行譜圖疊加比較[7]，見圖1和圖2。結果表明，各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊，說明儀器誤差較小，數據可靠。

圖1 QC樣品正離子模式總離子流色譜圖

圖2 QC樣品負離子模式總離子流色譜圖

2.2 飲料發酵前后代謝物PCA

通過MSDIAL軟件提取代謝物離子峰[8]。將所有實驗樣本和QC樣本提取得到的峰，經Pareto scaling處理后進行PCA，經7次循環交互驗證得到PCA模型如圖3所示，QC樣本較緊密聚集，說明實驗的重復性良好。

圖3 主成分分析圖

2.3 飲料發酵前后代謝物PLS-DA

將A組與B組數據處理后，得到PLS-DA得分圖。如圖4所示，飲料發酵前后的代謝產物明顯分離，表明各組之間存在顯著差異，全部樣品組都位于置信區間內，建立比較組的PLS-DA模型，經7次循環交互驗證得到的模型評價參數(R2Y，Q2),R2Y=0.999 和Q2=0.96均接近 1，表明模型越穩定可靠。

圖4 飲料發酵前后的PLS-DA模型得分圖

2.4 飲料發酵前后代謝物的OPLS-DA

將A組與B組數據處理后，得到OPLS-DA得分圖。如圖5所示，飲料發酵前后的代謝產物明顯分離，表明各組之間存在顯著差異，全部樣品組都位于置信區間內，同時參數R2Y=0.999，Q2=0.939均接近1，說明模型穩定，數據可靠。結果顯示，截距Q2=-0.173 <0，表明OPLS-DA模型不存在過擬合。

a-模型得分圖；b-置換檢驗圖

2.5 飲料發酵前后的差異代謝物鑒定

根據OPLS-DA結果，變量影響投影(variable in-fluence on projection, VIP)值來衡量各代謝物的組間差異對各組樣本分類判別的影響強度[9]。本實驗中以VIP>1且P<0.05作為具有顯著性差異代謝物篩選條件。對發酵前后的飲料進行比較，共檢測出顯著差異代謝物30類131種。主要包括氨基酸及其衍生物，有機酸及其衍生物，核苷酸，黃酮類，酯類等5類，分別占比為14.5%，18.3%，10.7%，9.9%，9.2%。

2.6 飲料發酵前后差異代謝豐度變化分析

以差異倍數(fold change, FC)>2或FC<0.5，且VIP>1，P< 0.05作為篩選標準，圖6顯示了比較A組和B組的火山圖。圖中紅色點表示上調，綠色點表示下調。由圖6可以看出其中58種代謝物顯著上調，73種代謝物顯著下調。

圖6 飲料發酵前后的火山圖

2.7 主要差異代謝成分分析

比較發酵飲料前后樣品中代謝成分的差異倍數變化，以FC>70和FC<0.014且VIP>1，P<0.05為指標，變化顯著的代謝物共篩選出14種如表3所示，其中提高的代謝物有7種，主要包括萘酚類衍生物1種，核苷酸1種，苯丙酸1種，氨基酸及其衍生物2種，黃酮類2種。降低的有7種，主要包括煙酰胺類1種，抗生素1種，有機酸2種，核苷酸2種，磷酸酰肌醇類1種。

表3 飲料發酵前后差異代謝物

2.8 代謝通路分析

通路富集分析可獲得63種差異代謝通路，其中27個通路存在顯著差異(P<0.05)。其中排在前10的代謝通路見圖7。差異代謝物數量富集最多的前5條通路分別是(1)纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)，主要包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝等23種代謝成分;(2)酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)，主要包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，異喹啉生物堿生物合成等78種代謝成分；(3)雙組分系統(two-component system)，主要包括光合作用，肽聚糖生物合成，氧化磷酸化等53種代謝成分；(4)嘌呤代謝(purine metabolism)，主要包括磷酸戊糖途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，硫胺素代謝，組氨酸代謝等95種代謝成分；(5)檸檬酸循環(citrate cycle)，主要包括氧化磷酸化，二羧酸代謝，脂肪酸生物合成等20種代謝成分。

圖7 顯著差異代謝物 KEGG富集圖

3 討論與結論

以2種乳酸菌為發酵劑混合發酵的玉米副產物飲料為研究對象，從發酵飲料中檢測出518種代謝產物，差異代謝物131種占總代謝物的25%。主要包括氨基酸及其衍生物、有機酸及其衍生物、核苷酸、黃酮類和酯類等5類，分別占比為14.5%、18.3%、10.7%、9.9%、9.2%。氨基酸是構建細胞、修復組織的基礎材料，是機體生長發育所必需的營養物質，也是調節代謝，增加抵抗力所需物質[10]，氨基酸缺乏會導致低血糖[11]。有機酸類似于抗生素具有殺菌和抑菌的特性[12]。核苷酸具有抗氧化作用，食物中缺乏核苷酸可損害肝臟、心臟、腸道和免疫系統[13]。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、抗菌、抗病毒活性[14]以及良好的抗氧化活性[15]。酯類化合物具有抗氧化、抗癌、降低膽固醇、減肥、降血糖血脂等多種生理功能[16]。

飲料發酵后顯著變化的主要有增加了13 548倍的1-羥基-2-萘甲酸，其具有抗病毒、降血壓、抗癌等功效[17]；增加了326倍異戊烯，異戊烯有多抗病菌、降血壓、抗真菌、抗氧化、抗艾滋病病毒、抗腫瘤等功效[18]；增加了208倍的表兒茶素，表兒茶素對心腦血管有防治作用，是金蕎麥抗菌、消炎、鎮咳的主要成分[19]，同時還有預防腫瘤和抗氧化作用[20]。

差異代謝物數量富集最多的前5條通路中，L-亮氨酸與L-異亮氨酸、L-纈氨酸均是必需氨基酸之一，也被稱為支鏈氨基酸，能促進人體肌肉發育，增強肝臟免疫力，緩解疲勞，更容易降低肥胖者體重[21]。亮氨酸可對危重病人提供所需營養，也可調節哺乳動物骨骼肌蛋白質的代謝。還可加速體內脂肪氧化分解[22]。L-異亮氨酸能促進人體新陳代謝，補充人體必需營養物質。酪氨酸的代謝紊亂可引發多種遺傳性疾病，如尿黑酸癥[23]，纈氨酸可以治療營養不良癥[24]；對于大多數的原核生物和極少數的真核生物而言，雙組分系統在適應環境等方面非常重要[25]。嘌呤代謝提供了大量重要生物合成所需的能量和輔助因子可作為癌細胞增殖的能量和底物[26]。嘌呤代謝異常能引發很多疾病如痛風、免疫系統疾病、血液疾病、腎臟疾病等[27]。檸檬酸循環是生物體內糖類、脂肪和蛋白質等能量營養物質氧化供能的共同途徑，還是生物體內能量營養物質生物氧化“逐步釋能”的關鍵環節[28]。

本研究建立了基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術的非靶向代謝組學方法[29]。對發酵前后代謝物進行初步鑒定比較，該方法具有良好的重復性和精密度。確定了乳酸菌能夠促進玉米及其副產物發酵飲料次級代謝的合成和積累，為乳酸菌用于玉米及其副產物飲料的發展提供理論參考。