不同配料青稞大曲理化特性與微生物群落相關性研究

古翀羽，冉茂芳，魏陽，張立強,3*，王松濤,3，沈才洪,,3*，李東

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644000) 2(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州，646000)3(國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川 瀘州，646000)

青稞中富含淀粉、適量的蛋白質和脂肪，是較好的釀酒和制曲原糧[1]。青稞酒主要以青稞為原糧，青稞、豌豆制成的中低溫大曲為糖化發(fā)酵劑，以青石板或瓷磚窖為發(fā)酵容器，經一次投糧，“清蒸清燒四次清”的發(fā)酵工藝釀造而成[2]。受大曲質量、原糧品質及釀造工藝的影響，青稞酒生產過程中存在淀粉利用率低、發(fā)酵周期長、出酒率低等問題。曲乃酒之骨，大曲對白酒發(fā)酵的啟動尤為重要，其不僅是白酒發(fā)酵的原料之一，而且是重要的微生物、酶制劑和風味物質來源。青稞大曲為青稞酒釀造的主要大曲，因青稞中富含β-葡聚糖、玻璃質等成分[3]，使得青稞大曲曲坯的黏度較高，且過于致密，不利于營造微氧發(fā)酵環(huán)境。其次，青稞大曲釀造地處高原，氣候干燥，日均氣溫低，環(huán)境微生物豐度低。大曲釀造過程中水分蒸發(fā)量大，頂點溫度持續(xù)較短，成熟期較早，導致微生物的捕捉及富集能力較弱，成品青稞大曲的糖化力、液化力、發(fā)酵力等指標較低，可能造成青稞酒釀造過程中淀粉利用率低、發(fā)酵周期長和出酒率較低[2-3]。

目前，對青稞大曲的研究主要集中在傳統(tǒng)藏曲、微生物群落結構[4-5]和風味組分的剖析[6-7]，而對青稞制曲工藝研究以提升青稞大曲質量的文獻報道較少。本文針對青稞大曲存在的上述問題，擬以青稞為主要原料，輔以小麥、麩皮或竹纖維制作中低溫大曲，對大曲的理化特性、微生物群落及風味組分分析，初步評價青稞大曲的品質，為提升青稞大曲質量、推進青稞制曲工藝發(fā)展提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞，青海三江集團；軟質小麥、麩皮，本地市售；竹纖維，本地市售鮮竹。

氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸、五水硫酸銅、可溶性淀粉、酒石酸鉀鈉、酪蛋白、L-酪氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等(均為分析純)，聚合化工；2-辛醇、己酸乙酯、己酸(均為色譜純)，Sigma-Aldrich。

1.2 儀器與設備

SP-756P紫外可見分光光度計，上海屹譜儀器有限公司；MLS-375L全自動滅菌鍋，日本日立公司；DHG-9245A烘箱，上海一恒科學儀器有限公司；DL-1電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機，德國艾本德公司；GC/MS-QP2020氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 制曲

結合文獻[8]報道的方法，以工業(yè)化機械制曲制備中低溫青稞大曲。純小麥曲為主流的中低溫大曲，因此，以其為標準和對照曲。不同青稞大曲配料如表1所示，其中，A～I和M為生料制曲，J～L為熟料制曲：原料120～150 ℃炒10～15 min，原料粉碎度為過20目篩的不超過35%～45%，竹子粉碎度為過20目篩。

1.3.2 取樣

中低溫大曲發(fā)酵結束后，貯存3個月，采用5點取樣法從曲房不同位置采集成品樣，將樣品搗碎，混合均勻，取500 g大曲粉于無菌取樣袋中立即密封，共取2份，1份保存在-20 ℃用于理化特性及風味物質檢測，1份保存在-80 ℃用于基因組DNA的提取。

1.3.3 理化指標的檢測

酸度、淀粉、水分、糖化力、發(fā)酵力、液化力、酯化力均參考QB/T 4257—2011《通用大曲分析方法》中的步驟[9]；蛋白質測定：凱氏定氮法[10]；脂肪的測定：索氏抽提法[11]；還原糖測定：斐林試劑法[8]；酸性蛋白酶活力測定：福林-酚試劑法[12]。

1.3.4 大曲微生物基因組DNA提取

稱取5 g大曲粉，用SDS法提取大曲樣品中微生物的基因組DNA。基因組DNA送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序，測序數(shù)據在美吉生物云平臺(https://cloud.majorbio.com/)進行處理。

1.3.5 大曲風味組分分析

采用頂空固相微萃取結合GC-MS測定大曲中風味組分的種類和含量。

1.3.6 數(shù)據分析方法

大曲的理化指標用SPSS 23.0進行顯著性分析。用OriginPro 9.0作柱形圖。結果用平均值±標準偏差的形式表示。樣本組間微生物群落差異heatmap圖用R語言pheatmap程序包繪制。

2 結果與分析

2.1 大曲原料的理化指標分析

原料中豐富的營養(yǎng)物質為微生物的生長提供了必要的碳源、氮源、生長因子、無機鹽和水分。測定原料的理化指標對大曲的總體預評估具有重要的意義[13]。如表2所示，3種原料的水分含量均在14%(質量分數(shù))以下，淀粉含量充足，且含有一定量的蛋白質和少量脂肪，能夠滿足微生物的生長需求，為微生物產酶和風味物質提供充足的條件，可用于制曲[8]。為解決傳統(tǒng)青稞大曲黏度較高和曲坯致密這一問題，擬將青稞輔以不同比例的麩皮、小麥和竹纖維進行生料制曲，有利于增加青稞大曲的疏松度，營造更有利于微生物生長的微氧發(fā)酵環(huán)境。同時，本文也進行了熟料制曲，增加原料的糊化和液化，以促進微生物的生長繁殖。

表2 原糧的營養(yǎng)成分含量 單位：%(質量分數(shù))

2.2 不同青稞大曲的理化特性分析

2.2.1 不同青稞大曲的理化指標分析

不同青稞大曲的水分、酸度、還原糖和淀粉含量如圖1所示，大曲的含水量為12%～16%(質量分數(shù))，隨著青稞含量的增加，毛細現(xiàn)象明顯，大曲水分含量越低，均滿足成品曲長期貯存的要求[8]。青稞大曲的酸度較低，青稞+麩皮生料配方間的酸度差異明顯，其余青稞大曲的酸度相近。大曲中還原糖含量差異較大，可能與產淀粉酶的微生物的豐度及微生物的生長繁殖代謝差異有關。大曲淀粉含量為58%～64%(質量分數(shù))，生料小麥曲的最高，熟料曲的次之，添加麩皮的生料曲最低，可能與不同原料淀粉的含量有關。特別地，熟料制曲還原糖整體處在較高的水平，可能與其提前進行糊化和液化，利于微生物分解利用有關，也可能與其黏度較高，曲坯溶氧不足，微生物生長代謝消耗較少有關。

a-水分含量;b-酸度;c-還原糖含量;d-淀粉含量

2.2.2 不同青稞大曲的酶活力分析

糖化力、液化力、發(fā)酵力、酯化力和酸性蛋白酶活力是大曲的重要功能指標，對其檢測有助于初步評估大曲的質量[8]。大曲的酶活力指標如圖2所示，不同大曲的各種酶活力差異顯著(P<0.05)。對照曲M的液化力最高(1.60±0.01) U，A、B和C曲的糖化力最高，為(1 132.80±35.64)～(1 166.40±31.9) U，熟料大曲的液化力和糖化力最低。F曲的發(fā)酵力最高，為(5.00±0.07) U，D、J和L曲的最低。H曲的酯化力最高，為(397.20±3.96) U，M曲的最低。H、J和G曲的酸性蛋白酶活力較高，F(xiàn)曲的最低。整體上，青稞大曲的液化力低于小麥曲，酯化力高于小麥曲，青稞生料曲的發(fā)酵力與小麥曲相近。添加麩皮有利于增加糖化力，添加竹纖維和熟料制曲有利于增加酯化力和酸性蛋白酶活力。與文獻報道[14-15]相比，本文所得大曲的液化力和酯化力正常，糖化力、發(fā)酵力和酸性蛋白酶活力較高。

a-發(fā)酵力；b-液化力；c-糖化力;d-酯化力；e-酸性蛋白酶活力

2.3 不同青稞大曲的微生物群落分析

2.3.1 不同青稞大曲細菌群落結構

大曲細菌群落組成(<1%合并為others)如圖3所示，不同大曲中檢出18種優(yōu)勢細菌，且細菌組成相似，但豐度存在差異。乳酸菌(Weissella、Lactobacillus、Leuconostoc、Enterococcus、Pediococcus)為異養(yǎng)厭氧菌，發(fā)酵過程中，隨著微生物的生長，曲坯溶氧量下降，演變?yōu)閮?yōu)勢菌，豐度在48.09%～92.07%。與M曲相比，添加麩皮、小麥、竹纖維的生料和熟料制作的青稞大曲中魏斯氏菌屬(Weissella)的豐度顯著增高，而乳桿菌屬(Lactobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和Carnobacterium的豐度顯著降低。其次，添加麩皮、小麥和竹纖維的生料青稞大曲中糖多胞菌屬(Saccharopolyspora)和片球菌屬(Pediococcus)的豐度增加，而腸球菌(Enterococcus)等的豐度降低。熟料制作的大曲中明串珠菌屬(Leuconostoc)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和蒼桿菌屬(Ochrobactrum)的豐度顯著增加。

圖3 不同青稞大曲的細菌群落結構

不同配料導致曲坯疏松度和微氧環(huán)境存在差異，發(fā)酵溫度變化差別明顯，雖然細菌對溫度的耐受性較高[16]，但是對溶氧量的需求不同，可能導致青稞大曲細菌豐度存在差異。乳酸菌為白酒發(fā)酵的重要功能微生物之一，可促進美拉德反應和白酒的發(fā)酵，維持與保護釀酒微生態(tài)，其合成的乳酸和醋酸是乳酸乙酯、乙酸乙酯等風味物質的前體，有利于增加白酒的濃厚度和豐富白酒的風味[17]。Saccharopolyspora在A曲中的豐度最高，為放線菌的一種，可合成酶類、維生素、纖維素促降解因子等，其在白酒發(fā)酵中的作用需進一步研究[18-21]。Staphylococcus在G、I和M曲中的豐度也較高，能夠利用還原糖產酸，對大曲的風味有一定的貢獻[16]；芽孢桿菌(Bacillus)能夠合成淀粉酶和蛋白酶，可分解某些大分子物質合成雙乙酰，且與大曲中己酸乙酯的形成有關[22]，但在各樣本中的豐度較低，與吳樹坤等[18]的研究相似。

2.3.2 不同青稞大曲真菌群落結構

大曲真菌群落組成(<1%合并為others)如圖4所示，不同大曲中共檢出14種優(yōu)勢真菌，且真菌組成差異明顯，酵母菌(豐度31.45%～50.92%)和霉菌(豐度48.64%～66.81%)為B、C和D曲的優(yōu)勢真菌，霉菌(豐度73.22%～94.35%)為E、F、G、H和M曲的優(yōu)勢真菌，而酵母菌(豐度83.53%～95.36%)為A、I、J、K和L曲的優(yōu)勢真菌。添加麩皮、小麥和竹纖維有利于曲霉屬(Aspergillus)的生長，后二者也有利于嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)的生長，而熟料制曲不利于霉菌的生長。其次，添加麩皮和熟料制曲有利于酵母菌如假絲酵母屬(Candida)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、葡萄牙棒孢酵母屬(Clavispora)和Diutina等的生長，且隨著麩皮量的減少，酵母菌的豐度增加。霉菌為好氧微生物，酵母菌為兼性厭氧微生物，對溫度的耐受較弱[16]。隨著麩皮、生小麥和竹纖維用量的增加，大曲疏松度增加，且添加竹纖維的疏松度最高，導致曲坯溶氧較高。因此，添加小麥和竹纖維營造的曲坯疏松度、溶氧環(huán)境可能有利于霉菌的生長。添加麩皮所營造的曲坯疏松度和溶氧環(huán)境可能有利于霉菌和酵母菌的生長。熟料大曲曲坯的黏度較大，疏松度和溶氧較低，有利于酵母菌的生長。因此，曲坯的疏松度、微氧環(huán)境及發(fā)酵溫度對真菌的生長有較大的影響。不同配料導致曲坯疏松度、微氧環(huán)境和發(fā)酵溫度變化存在差異，使得青稞大曲真菌組成差異顯著。Thermonascus和Thermomyces為耐熱真菌，產纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶和脂肪酶等酶類，對白酒發(fā)酵有重要作用[18]。Aspergillus能夠合成纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、果膠酶和有機酸，也是白酒發(fā)酵的重要功能微生物[23]。酵母菌(Candida、Issatchenkia、Kodamaea、Wickerhamomyces、Clavispora、Trichosporon)主要合成乙醇、多元醇和酯類等，對白酒的產酒和生香有重要作用。有些酵母菌如Candida、Saccharomycopsis、Issatchenkia等也可分泌淀粉酶、蛋白酶或β-葡萄糖苷酶，分解原料中的大分子物質，為白酒風味物質的形成提供前體，有利于提高基礎酒的品質[23]。

圖4 不同青稞大曲的真菌群落結構

2.3.3 不同青稞大曲微生物群落差異性分析

微生物群落相似性熱圖如圖5所示。細菌群落方面，M和G聚為一簇，其細菌群落相近，其余樣品聚為一簇，它們的細菌群落相近，由于微生物如Acetobacter、Saccharopolyspora、Paracoccus、Carnobacterium、Chloroplast、Streptomyces、Sphingobacterium、Enterococcus和Corynebacterium等的豐度影響又聚為幾小簇，C和D、E和H、B和F的細菌群落分別更相近，而I、J、K和L的更相近。同細菌群落分析一致，不同配料對青稞大曲細菌組成有影響但不顯著。真菌群落方面，B、C、D、F、M、G、E和H聚為一簇，由于B的酵母菌豐度(50.92%)略高于霉菌豐度(48.64%)，單獨聚為一簇，而C和D的霉菌豐度(51.85%、66.81%)略高于酵母菌豐度(47.10%、31.45%)，二者聚為另一小簇，F(xiàn)、M、G、E和H因霉菌豐度在73.22%～94.35%，聚為另一簇，E和H單獨聚為一小簇，結果表明，B、C、D、F、M、G、E和H的真菌群落相近，C和D的更為相近，E和H的更為相近。A、I、J、K和L以酵母菌為最主要的優(yōu)勢真菌，聚為另一簇。同真菌群落分析一致，添加生小麥和竹纖維有利于霉菌的生長，添加麩皮和熟料制曲有利于酵母菌的生長，不同配料對青稞大曲真菌組成影響顯著。

a-細菌；b-真菌

2.4 不同青稞大曲微生物群落與酶活力相關性分析

計算酶活力與屬水平豐度前18的細菌及前14的真菌的Pearson相關系數(shù)，繪制相關性熱圖，如圖6所示。液化力與Thermoascus極顯著相關，與Saccharopolyspora顯著相關，與Lactobacillus、Chloroplast和Aspergillus呈一定的相關。糖化力與Saccharopolyspora極顯著相關，與Lactobacillus、Chloroplast、Pediococcus、Thermoascus、Kodamaea、Aspergillus、Clavispora呈一定的相關。Thermoascus和Aspergillus均合成淀粉酶，Thermonascus在添加麩皮、小麥和竹纖維的大曲中的豐度較高，可產生更多的淀粉酶，大曲的糖化力和液化力較高。與Thermoascus相比，Aspergillus的豐度較低，可能導致其與糖化力和液化力相關性不顯著。而熟料制曲不利于霉菌生長，Thermoascus的豐度很低，可能導致液化力和糖化力較低。Saccharopolyspora與糖化力和液化力顯著相關，其在大曲中的功能報道較少，仍需進一步的研究。

a-細菌；b-真菌

發(fā)酵力與Chloroplast顯著相關，與Lactobacillus、Pantoea、Pediococcus、Thermoascus、Aspergillus、Thermomyces呈一定的相關，還與Kodamaea和Rasamsonia有一定的正相關，但相關系數(shù)略低于前述微生物。采用麥芽浸粉代替高粱粉糖化液測定的發(fā)酵力為糖化發(fā)酵力。添加麩皮、小麥和竹纖維的生料青稞大曲的糖化力和液化力較高，發(fā)酵時還原糖的含量高，有利于酵母菌增殖和代謝，呈現(xiàn)出較高的發(fā)酵力。熟料大曲的糖化力和液化力較低，雖然其酵母菌豐度高，但還原糖較低的情況下，酵母菌增殖和代謝緩慢，呈現(xiàn)出較低的發(fā)酵力?？赡軐е掳l(fā)酵力與酵母菌的相關性較差。Leuconostoc、Rasamsonia和Diutina與酯化力呈一定的相關性，酵母菌Rasamsonia的相關系數(shù)>0.50，較其余2種的相關系數(shù)高。微生物與酯化力的相關性并不顯著，與李媛媛等[14]的研究結果一致，但具體原因需進一步研究。大曲中的酸性蛋白酶可能主要由細菌合成，酸性蛋白酶活力與細菌的相關系數(shù)遠高于真菌相關系數(shù)。不同青稞大曲中各功能微生物豐度的差異以及微生物間的相互協(xié)同作用，可能導致其酶活力差異顯著。

2.5 不同青稞大曲風味成分分析

大曲在白酒發(fā)酵中不僅起到提供菌源、糖化發(fā)酵和投糧的作用，還起到生香的作用。大曲的生香作用主要是醇酸酯化、前體物質轉化及菌源生香得到大曲酒的主體香[8]。因此，分析大曲風味物質有利于初步判斷酒曲的質量。大曲中風味物質的種類和含量如圖7所示。風味物質種類方面，在A～M編號的13種大曲中分別檢出56、49、47、51、47、49、56、45、55、47、53、47和56種風味物質。A、G和M曲的最多，其次為I曲和K曲，C、E、H、J和L曲的最少，可能與不同大曲中功能微生物的多樣性差異有關。在含量方面，不同大曲風味物質的含量差異顯著，K曲風味物質的含量最高，其次為M和A曲，F(xiàn)曲的含量最低。B、E、G和H曲的風味物質含量相近，與其功能微生物群落結構相似結果一致。大曲中的風味物質主要來源于微生物代謝合成，相似的微生物群落結構導致相應曲藥中風味物質的含量相近。醇類、酯類和酮類為大曲中主要的風味物質，其他風味化合物的含量相對較低。如附表1https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20210509009所示，正己醇、1-庚醇、2-乙 基-1-己醇、1-辛醇、苯乙醇、雪松醇、1-壬醇為大曲中的優(yōu)勢醇類，主要由酵母菌在厭氧條件下轉化氨基酸和在有氧條件下轉化糖類，或酵母主導的相應醛類的還原生成，較其他大曲，熟料大曲中酵母菌的豐度較高，可能導致這些醇類在熟料大曲中的含量相對較高，而酵母菌豐度的差異可能導致其他大曲中醇類的含量不同。大曲中的主要酯類為甲酯類，如棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、十六碳烯酸甲酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二丁酸酯，同YAN等[24]的研究一致，多數(shù)酯類在K曲和M曲中的含量高于其他大曲。酯類主要由微生物代謝產生和酸醇的酯化生成，熟料更有利于微生物的使用，酵母菌豐度和微生物的代謝差異可能導致大曲中酯類含量不同。2-己烯醛，壬醛、2,5-二羥基苯甲醛、苯甲醛、苯乙醛為主要的醛類組分，在不同大曲中的含量差異明顯，但并未呈現(xiàn)一定的規(guī)律，可能與原料帶來的發(fā)酵環(huán)境、營養(yǎng)物質的差異及微生物代謝活性和差異有關。2-辛酮為主要的酮類組分，賦予大曲蘑菇、土壤氣息，隨著麩皮、小麥、竹纖維含量的增加，其含量呈現(xiàn)下降的趨勢，添加麩皮和熟料的大曲中含量較高。三甲基吡嗪和四甲基吡嗪為主要的含氮類化合物，且在熟料大曲中的含量較高。吡嗪類主要由氨基和羰基化合物間的美拉德反應以及微生物合成或轉化乙偶姻、丙酮醇和氨基丙酮生成。原料經炒制后，更有利于淀粉、蛋白質的分解，為吡嗪的生成提供更多的氨基和羰基化合物，可能導致其吡嗪類化合物的含量較高。

a-種類；b-含量

3 結論

本文對不同配料青稞大曲的理化特性、微生物群落結構及風味組分進行了研究，結果表明，不同大曲的理化指標差異顯著，添加麩皮有利于增加大曲的糖化力和發(fā)酵力，添加竹纖維和熟料制曲有利于增加大曲的酯化力和蛋白酶活力。其次，不同大曲的微生物群落結構差異顯著，乳酸菌為主要的優(yōu)勢細菌，酵母菌和霉菌為優(yōu)勢真菌。不同配料對大曲中細菌群落有影響但不顯著，對真菌群落結構的影響顯著，可能與原料配比賦予大曲曲坯的疏松度、微氧環(huán)境和發(fā)酵溫度差異及微生物的生長屬性有關。不同大曲中各功能微生物豐度的差異以及微生物間的相互協(xié)同作用，可能導致各種酶活力差異顯著。醇類、酯類和酮類為大曲中主要的風味物質，風味物質的差異可能與功能微生物的多樣性及豐度有關，熟料制曲有利于風味物質的合成。因此，可根據發(fā)酵目的選擇合適的大曲，要達到一個較好的糖化和液化效果，保證較好的出酒率，可選擇添加麩皮的青稞大曲，而要獲得酯香突出、香氣豐富的清香型白酒，則可選擇添加竹纖維的青稞大曲，也可對不同大曲進行搭配使用。