內皮祖細胞來源的外泌體降低顱內動脈瘤破裂的研究進展*

尉輝杰 劉 卉 劉首峰 楊貴莉 俞 凱 岳樹源 江榮才 張建寧

1 天津醫科大學總醫院神經外科，天津市 300052； 2 天津市神經病學研究所； 3 天津市環湖醫院

目前，降低未破裂顱內動脈瘤(Unruptured intracranial aneurysms，UIAs)破裂的手術治療方式主要是開顱夾閉術和介入栓塞。UIAs破裂的機制及降低其破裂的合理治療方式尚不十分明確，尋找一種能有效降低UIAs破裂的非手術治療方式具有重要意義。近年來，國內外研究提示，EPCs來源的外泌體(EPCs-Exos)介導的血管新生在血管損傷后內皮修復過程中發揮重要作用，可延緩顱內動脈瘤的進展，在降低顱內動脈瘤破裂方面具有重要意義。本文通過回顧國內外相關文獻，并結合筆者課題組近年來的研究成果，將重點闡述EPCs-Exos參與降低顱內脈瘤破裂的機制及潛在應用前景，提出應用EPCs-Exos治療未破裂顱內動脈瘤的創新策略，為臨床轉化奠定基礎。

1 非手術治療方式降低顱內動脈瘤破裂的重要臨床意義

顱內動脈瘤(Intracerebral aneurysms，IAs)破裂后形成蛛網膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)，是一種神經外科常見急癥。其預后差，病死率為45%～49% ，存活者的殘障率超過50%[1]，給患者個人、家庭和國家帶來沉重的精神壓力和經濟負擔。近年來隨著CTA、MRA等無創性血管檢查的出現與普及，UIAs的發現率逐年提高。一直以來， 降低UIAs破裂風險的手術治療方式主要是開顱夾閉術和介入栓塞。這兩種治療方式發生手術并發癥的風險與UIAs破裂時可能出現的嚴重后果是幾乎接近的。國內外學者一致認為，降低UIAs破裂風險的最理想方式應該是非手術治療，如藥物和細胞移植等。通過非手術治療修復顱內動脈瘤受損的內皮，減小其體積，增加動脈瘤壁抗張性能以及降低破裂風險是當前研究的重點與熱點問題之一。

2 過度炎癥反應所引起的血管重塑能力下降在顱內動脈瘤破裂中的作用

以往研究認為顱底willis環動脈壁中膜層變薄和內彈力層退變是顱內動脈瘤形成的主要原因[2]。近年來有研究認為，血管內皮細胞受損是顱內動脈瘤形成的始動環節和促發因素。在持續異常高血流動力刺激下，血管分叉部內皮細胞易發生損傷，出現內皮功能障礙，可以激活內皮細胞內促炎癥信號通路，引發由NF-κB介導，多種炎癥介質(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-6、TNF-α、IL-1β)參與的血管壁過度炎癥反應。MMPs介導的細胞外基質分解破壞，以及平滑肌細胞過度凋亡，致使血管結構重塑能力下降[3]。基于上述病理變化，在高血流作用下局部管壁繼續外向膨出，動脈瘤不斷進展惡化，直至破裂 。血管內源性保護機制及其微環境的紊亂可以引起一系列瀑布鏈式反應，激發血管內皮損傷進一步惡化，最終引起動脈壁結構的破壞，從而誘發顱內動脈瘤的形成、發展至破裂。因此，筆者有理由推斷：延緩或逆轉這一過程可有效降低顱內動脈瘤的破裂。

3 循環血EPCs缺陷介導的血管自身修復能力下降是影響顱內動脈瘤破裂的關鍵因素

“過度炎癥反應學說”主要強調血管損傷因素，但受損狀態下，體內血管自身修復機制在顱內動脈瘤形成與破裂過程中的作用尚未得到足夠重視。內皮損傷后，血管新生介導的血管損傷后內皮修復能力也是影響顱內動脈瘤破裂的關鍵因素之一。筆者所在課題組既往的研究顯示[4]，顱內動脈瘤患者循環血EPCs數量減少、遷移能力下降和衰老比率增加。研究組借助Hashimoto大鼠顱內動脈瘤模型發現，顱內動脈瘤大鼠外周血EPCs呈逐漸下降的趨勢。利用EPO[5]提高EPCs可以有效地降低顱內動脈瘤的形成、延緩進展以及降低其破裂風險。通過蛋氨酸飲食[6]降低大鼠循環血EPCs可以有效提高顱內動脈瘤的形成、加速進展以及增加其破裂風險。阿托伐他汀可以通過促進血管新生來延緩顱內動脈瘤的進展，降低破裂風險[7-8]。國內的研究[9]證實，瑞舒伐他汀可以增強EPCs的功能，促進動脈瘤頸部內皮修復。基于上述研究，筆者分析：(1)EPCs缺陷所致的受損血管自身修復能力下降在顱內動脈瘤形成、進展與破裂過程中的作用十分重要；(2)EPCs缺陷增加了顱內動脈瘤破裂的風險；(3)增強EPCs介導的血管新生，可以促進IAs內血管損傷部分的內皮修復，在延緩顱內動脈瘤進展以及降低破裂風險方面發揮作用。

4 人臍血EPCs移植可以降低顱內動脈瘤破裂風險，為未破裂顱內動脈瘤的治療提供新思路

近年來，EPCs移植治療顱內動脈瘤的研究逐步得到國內外專家們的重視。研究證實，移植骨髓源性EPCs可以加速動脈瘤內皮增殖、瘤腔纖維化以及動脈瘤頸的愈合，加速動脈瘤修復[10]。Aronson JP等[11]在兔動脈瘤研究中發現， EPCs移植治療可促使動脈瘤腔內完整內皮層的形成，參與動脈瘤瘤頸部位損傷內皮的自身修復。Li ZF等[12]利用豬胰彈性蛋白酶浸泡兔右頸總動脈，誘導形成頸總動脈瘤，并將血管導向裝置植入動脈瘤，研究表明EPCs可參與動脈瘤腔的修復和新生內膜形成。筆者所在課題組前期研究[13]顯示：移植人臍血EPCs可以促進血管新生，阻斷內皮功能障礙，延緩了動脈瘤性血管壁退行性改變，起到了血管保護作用，對降低動脈瘤破裂風險有治療作用。課題組借助同種大鼠EPCs移植及示蹤實驗，利用FISH法觀測到循環血EPCs可以歸巢定位至動脈瘤形成部位，獲得EPCs介導的血管新生參與顱內動脈瘤形成、進展至破裂的直接證據。同時還發現：內皮祖細胞分泌的細胞因子可促進EPCs的遷移和歸巢，參與損傷血管的修復。以上研究結果表明：靜脈移植人臍血EPCs可以促進動脈瘤瘤頸部損傷內皮的自身修復，延緩動脈瘤的進展，降低了動脈瘤破裂的風險，可有望成為未破裂顱內動脈瘤預防性治療的理想干預手段，為未破裂顱內動脈瘤的治療提供新思路。

5 人臍血EPCs來源外泌體(EPC-Exos)在降低顱內動脈瘤破裂方面的作用及應用前景

EPCs移植應用于預防UIAs破裂存在諸多的風險和不足，如干細胞致瘤性、免疫排斥反應以及病原微生物污染等。這些問題成為制約其臨床應用的瓶頸，成為干細胞研究中一大障礙。這也是我們亟待解決的核心和關鍵問題之一，尋找一種能替代EPCs并回避這些風險和不足的新療法具有深遠的意義。近年來的研究證明：直接應用干細胞來源的外泌體治療，可以避免直接應用干細胞帶來的一系列風險，具有非常廣闊的應用前景。EPCs來源的外泌體(EPC-Exos)作為一種細胞微環境內的介質，可以在細胞與細胞間的溝通中調節內皮細胞的功能。EPC-Exos從EPCs分泌后，通過其內富含的蛋白質、mRNA和miRNA來調控血管新生，促進內皮細胞的再生，穩定血管內微環境穩態，從而增強損傷內皮的自身修復能力。近年來，Li X等[14]用內皮祖細胞來源外泌體(EPC-Exos)分別處理頸動脈損傷和糖尿病大鼠，結果發現EPC-Exos處理后，血管內皮細胞的增殖和遷移能力均明顯增強，提示EPC-Exos能夠促進血管新生，修復損傷的血管內皮細胞。也有學者發現EPC-Exos通過增強血管新生，促使成纖維細胞向內皮細胞的分化，抑制心肌纖維化，從而改善心肌梗死患者的心功能。上述研究提示： EPC-Exos介導的血管新生在血管損傷后內皮修復過程中發揮重要作用。

外泌體在中樞神經系統疾病中的研究多集中于腦膠質瘤、神經退行性疾病、神經系統自身免疫性疾病、顱腦損傷、腦出血及腦梗死等，而EPC-Exos在顱內動脈瘤發病機制及治療中的作用鮮有報道。近年來，國內外學者開始關注外泌體在腹主動脈瘤發病機制及治療中的作用。Yamawaki-ogata等[15]在腹主動脈瘤的動物實驗中發現，輸注間充質干細胞來源的外泌體(MSC-Exos)通過降低血管壁的局部炎癥，促進損傷血管的內皮修復，可以延緩腹主動脈瘤的進展以及阻止其破裂，成為用于預防腹主動脈瘤破裂的非手術治療方式之一。在近期的預研究中，筆者已成功地從未破裂顱內動脈瘤患者外周血分離和提取EPC-Exos。為探討EPC-Eoxs在顱內動脈瘤破裂中的作用，筆者借助C57BL/6J顱內動脈瘤小鼠，發現經尾靜脈輸注人臍血EPCs來源外泌體(EPC-Exos)可以降低動脈瘤的破裂率，初步顯示EPC-Exos可以降低顱內動脈瘤的破裂。由此可見：EPC-Exos可以延緩顱內動脈瘤的進展，阻止顱內動脈瘤的破裂，在降低UIAs破裂方面具有廣闊的臨床應用前景。

6 EPC-Exos可能通過miRNA-126-3p抑制靶基因SPRED1降低顱內動脈瘤破裂

miR-126是促進血管新生的miRNA，在維持血管結構和穩定血管內皮細胞功能上發揮重要作用。 Wang S等人敲除小鼠體內miR-126后發現，miR-126的降低可致血管形成障礙以及血管壁破壞，而過表達的miR-126可以通過抑制SPRED1而促進血管形成，從而闡明miR-126對于維持血管結構的重要性。而且，miR-126在干細胞外泌體治療中發揮重要作用[16]，研究顯示：miR-126過表達的滑膜間充質干細胞外泌體可以促進損傷皮膚的修復。miR-126過表達的脂肪干細胞外泌體可以通過減少細胞凋亡、緩解局部炎癥、逆轉心肌纖維化以及促進血管新生而發揮其保護心肌細胞的作用，以減輕心肌損傷，從而改善心肌梗死的預后[17]。miR-126-3p高表達的CD34陽性干細胞分泌的外泌體(CD34-Exo)可以促進小鼠下肢缺血模型的血管生成。以上研究提示：miR-126是干細胞來源外泌體富含或分泌的與血管新生有關的microRNA，能促進內皮細胞的再生，并參與血管損傷后的內皮修復。筆者在前期研究中，將獲得的人臍血EPCs來源外泌體(EPC-Exos)進行miRNA高通量芯片檢測，篩選EPC-Exos與單個核細胞來源的外泌體(MNC-Exos)之間差異表達的miRNA，發現：人臍血EPC-Exos中miRNA-126-3p高表達。基于上述結果筆者推斷：(1)人臍血EPC-Exos富含miRNA-126-3p；(2)EPC-Exos降低顱內動脈瘤破裂風險與其富含miRNA-126-3p有關。

已有文獻報道，miR-126-3p能夠通過調控SPRED-1、SDF-1、VCAM-1、HoxA9、v-Crk、EGFL-7和VEGF等基因的表達，調節血管發育、新生血管形成以及血管炎癥反應等病理生理過程。在動脈硬化[18]的研究中顯示：miR-126-3p作用于 SPRED-1位點，抑制SPRED-1，增強Raf1/ERK通路，促進血管新生及內皮細胞增殖。此外，在CD34-Exos治療肢體缺血的實驗研究中也發現，miR-126-3p可以抑制靶基因SPRED1的表達來促進血管新生；SPRED1同時還調控血管新生相關因子的表達，如VEGF、ANG1、ANG2、MMP9、TSP1等。SPRED1是RAF/MAPK/MEK/ERK信號通路的抑制基因，對細胞生長和分化起重要作用。在血管內皮細胞中，它是血管內皮生長因子(VEGF)信號通路的負性調節因子。在既往的研究中，筆者也進行了miR-126-3p靶基因的分析和預測，并推測SPRED1是miR-126-3p的靶基因，可以激活下游VEGF/RAF/MEK/ERK/VEGF信號環路。

7 展望

上述問題是我們參考國內外研究，并結合筆者所在課題組研究成果基礎上做出的歸納總結，具體結果尚需要通過進一步的研究證實。今后我們將從臨床和基礎兩方面著手進行研究，努力探索內皮祖細胞來源的外泌體降低顱內動脈瘤破裂的機制，并驗證我們提出的假說，如下：EPCs來源外泌體通過miR-126-3p抑制靶基因SPRED1，促進血管新生，預防顱內動脈瘤破裂。綜上所述，預期結果及假說的提出將進一步完善顱內動脈瘤進展與破裂的病理生理學機制，基于結果，提出應用EPC-Exos治療未破裂顱內動脈瘤的創新策略，為臨床轉化奠定基礎。