HIPPO信號通路在心臟發(fā)育及疾病發(fā)生過程中的作用

趙南南 張洪亮

佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江省佳木斯市 154000

HIPPO信號通路成分首次在果蠅中被學者發(fā)現(xiàn)，由于其在生物發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，近年來逐漸成為研究熱點。在哺乳動物體內HIPPO信號通路通過調節(jié)細胞增殖、凋亡、分化和干細胞自我更新來控制包括心臟在內的許多器官的發(fā)育和內穩(wěn)態(tài)平衡[1]，其核心成分是高度保守的，由絲氨酸/蘇氨酸激酶級聯(lián)、轉錄協(xié)同激活因子和DNA結合蛋白組成。HIPPO通路在激酶級聯(lián)激活后，蛋白激酶Mst1/2與適配器蛋白SALV相互作用，使許多蛋白質[包括SALV、大型腫瘤抑制因子(Lats1/2)和Lats1/2相互作用蛋白MOB1]發(fā)生磷酸化，進而抑制促生長活性激活蛋白(Yes-associated protein，YAP)和轉錄協(xié)同激活因子與PDZ結合基序(Taz)的活性，使Yap和Taz在細胞質內保留或降解。相反，當HIPPO通路上游激酶失活時將導致Yap和Taz向細胞核內轉移，在細胞核內與包括Tead1-4在內的各種轉錄因子相互作用，誘導下游靶基因激活，產(chǎn)生促使細胞增殖、分化和遷移的作用[1]。綜上所述，HIPPO信號通路的主要功能是調節(jié)細胞增殖、凋亡和分化和限制成年動物的器官和組織生長。

1 HIPPO通路與心臟發(fā)育

心臟是胚胎發(fā)育過程中形成的第一個有功能的器官。它通過血管將充滿氧氣和營養(yǎng)物質的血液輸送到組織，以滿足其他器官發(fā)育。心臟發(fā)育不完全則不能向機體輸送足夠的血液，從而導致機體病理改變。Hippo信號通路在心肌三層結構(心肌層、心外膜層和心內膜層)的細胞中均有表達，在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

1.1 HIPPO通路與心肌 心肌細胞的增殖對心肌的正常生長至關重要。研究表明，Hippo信號通路在心臟發(fā)育過程中通過調節(jié)心肌細胞增殖來維持哺乳動物心臟的正常大小[2-4]。為了研究Hippo通路在心臟發(fā)育中的作用，Heallen等人采用基因失活的方法刪除胚胎小鼠心臟中的SALV、Mst1/2和Lats2，結果發(fā)現(xiàn)在這些突變體中心臟的整體模式不變，但是出現(xiàn)心肌細胞增殖、小梁擴張和心肌增厚，最終導致心臟異常增大[2]。Xin等人研究發(fā)現(xiàn)YAP缺失可導致心肌細胞增殖受損，發(fā)生致死性心臟發(fā)育不良和心肌層嚴重變薄；相反，心肌細胞特異性活化的YAP(YapS112A)的過度表達會導致心肌細胞增殖增強，進而導致新生小鼠心臟過度生長[3]。von Gise等人使用Tnnt2Cre系誘導活化的Yap(YapS127A) 過度表達出現(xiàn)外周出血、心臟腫大和劇烈的心肌過度生長導致心腔閉塞，最終導致E15.5的胚胎死亡[4]。Monroe等人研究發(fā)現(xiàn)在成人心肌細胞中過度表達活化的YAP(αMHCCre-ERT2；YAP5SA)導致增殖增加，進而導致心室壁增厚和心功能改善，且Yap5SA過表達可通過增加胚胎心臟增強劑在成人心臟中的可及性，誘導成人心肌細胞進入胚胎細胞狀態(tài)[5]。這些研究表明，YAP在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮著促進心肌細胞增殖、組織生長、心臟增大的調節(jié)作用。與Yap在心臟中公認的作用相反，Taz的作用還沒有被廣泛研究。最近，Xin等人發(fā)現(xiàn)敲除小鼠心臟特異性Taz基因是可行的，且不顯示任何明顯的心臟缺陷。但是，心肌細胞中Taz和Yap缺失的不同組合會導致基因劑量依賴性心臟缺陷，且Yap/Taz突變導致的心臟缺陷也與心肌細胞增殖增加和凋亡減少有關[6]。這說明Taz在心臟發(fā)育過程中也發(fā)揮著一定作用，但具體機制有待于進一步證實。TEAD家族轉錄因子通過Yap/Taz中的N端TEAD結合域與Yap和Taz相互作用。當Tead1位點被逆轉錄病毒基因捕獲而破壞時，出現(xiàn)心室壁變薄、心包腔增大、心動過緩和胚胎致死。同時有研究表明，Tead1在小鼠心臟中的過度表達可導致心肌病和心力衰竭。這表明Tead1對于正常的心臟發(fā)育也是至關重要的。

1.2 HIPPO通路與心外膜 心外膜是心臟最外層的間皮細胞層，在心臟發(fā)育中心外膜衍生細胞(EPDCs)可以分化為血管平滑肌細胞、冠狀動脈內皮細胞和間質成纖維細胞，故心外膜對于冠狀血管的正確形成是必不可少的[7]。心外膜是基礎心肌細胞增殖和分化所需的生長信號的重要來源。同時，心外膜細胞的行為也受來自心肌的信號調節(jié)。為明確HIPPO信號通路在冠狀動脈血管發(fā)育中的作用，Singh等人構建了心外膜特異性Yap/Taz雙突變胚胎模型，在該模型中觀察到胚胎的心肌薄而易碎，出現(xiàn)出血，最終在E11.5～E12.5左右死于心血管功能不全[8]。發(fā)生上述病理改變時由于心外膜中的Yap/Taz缺失，心外膜—心肌信號轉導受到損害，心外膜細胞增殖、上皮細胞向間充質細胞轉化和EPDCs分化為心臟其他細胞均受到影響。Xiao等人研究發(fā)現(xiàn)心外膜中Hippo通路的激酶Lats1/2的特異性缺失的胚胎中出現(xiàn)冠狀動脈血管重塑缺陷，導致E15.5的胚胎死亡，他們利用單細胞RNA測序方法進一步分析發(fā)現(xiàn)心外膜細胞中Lats1/2缺失抑制新外膜細胞向成纖維細胞分化，使其保持在具有心外膜細胞和成纖維細胞特征的中間細胞狀態(tài)。這些結果表明，Lats1/2在EPDCs從心外膜來源的祖細胞向完全分化的心臟成纖維細胞進展過程中發(fā)揮重要作用[9]。綜上所述，心外膜中的Hippo信號通路對于心外膜細胞向成纖維細胞分化和冠狀動脈血管發(fā)育是必需的。

1.3 HIPPO通路與心內膜 心肌的生長和成熟是由鄰近的心內膜細胞發(fā)出的信號編碼的[10]。在心臟發(fā)育中，心內膜細胞分泌中性調節(jié)蛋白1(Nrg1)并表達細胞表面配體Ephrin B2(Efnb2)，二者均向相鄰的心肌細胞發(fā)出信號以促進心肌生長和成熟。在心臟發(fā)育過程中Yap和Taz在心肌和心內膜細胞中均有表達[11]。Artapet等人研究發(fā)現(xiàn)在敲除心內膜特異性Yap和Taz后，可在Yap/ Taz雙突變胚胎中觀察到Nrg1表達水平降低，心室壁厚度減少，個體出生后死亡率增加；當添加外源性重組Nrg1時，突變體心臟致密薄層心肌可被挽救[11]。上述結果說明Yap/Taz通過介導心內膜中Nrg1的調節(jié)在心肌發(fā)育中發(fā)揮重要作用，故Hippo信號通路是心內膜/內皮細胞調節(jié)正常心臟發(fā)育所必需的。

2 HIPPO通路與心臟再生

在發(fā)生心肌損傷時成人心臟再生能力是有限的，而新生小鼠心臟能夠完全再生，但是這種完全再生的能力在出生后第7天(P7)就會喪失。由于Hippo信號轉導為胚胎發(fā)育期間心肌細胞增殖提供重要調節(jié)因子，故我們猜測Hippo通路在心臟再生/修復中也可能發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)YAP過度表達可延長新生兒心肌細胞活動周期并促進再生，表明Hippo信號通路對出生后心臟的心肌細胞增殖也具有重要作用[4]。Xin等人通過觀察結扎后心臟的缺血區(qū)域發(fā)現(xiàn)：來自P2新生野生型小鼠的心臟在心肌損傷后僅出現(xiàn)極小的纖維化，這說明P2野生型小鼠的心臟在心肌損傷后可完全再生；相反，P2的YAP缺失的突變體小鼠心肌損傷后顯示出廣泛的心臟纖維化，表明YAP缺失時心肌再生反應受損[6]。為了進一步證明YAP激活對于出生后心臟再生的影響，Xin等人在αMhc啟動子的控制下過表達的活化的YAP，構建出αMHC-YapS112A轉基因小鼠模型。并使野生型和αMHC-YapS112A轉基因小鼠均在P7受到心肌損傷，并在P21進行分析。結果發(fā)現(xiàn)：野生型小鼠在損傷后表現(xiàn)出廣泛的瘢痕形成，心肌組織丟失和心室擴張；而αMHC-YapS112A心臟完全再生，幾乎沒有纖維化[6]。

綜上所述，在心臟損傷后的再生過程中Hippo信號通路各組件發(fā)揮重要作用且 YAP 活性的平衡對心肌損傷后再生有意義。故Hippo-YAP信號通路在心肌損傷后再生過程中發(fā)揮重要調控作用。

3 HIPPO通路與心臟疾病

Hippo信號通路與各種心臟異常有關，包括心肌肥大、心力衰竭、致心律失常性心肌病、擴張型心肌病和缺血性心臟病等。

3.1 心肌肥厚 在心臟發(fā)育中，心肌細胞增殖扮演著重要角色。然而，由于成年心肌細胞增殖能力有限，出生后心臟生長主要受心肌細胞生理性肥大的控制。除生理性肥大外，心肌肥厚還可由多種病理條件引起。如心肌缺血/再灌注(I/R)損傷和心肌梗死(MI)可導致氧化應激和不可逆的心肌細胞損失，最終導致心力衰竭。機體為適應這些不利條件導致的心肌收縮力不足出現(xiàn)心室肌細胞肥大，從而增加壁厚、減少壁應力及細胞死亡。在生理和病理條件下YAP激活可在不影響心肌細胞大小的前提下增加胚胎和出生后心肌細胞的增殖[4]。YAP激活后通過促進心肌細胞存活、增殖和肥大來保護心臟不受心肌梗死的影響。且有研究表明Yap激活導致的心肌細胞存活由AKT和或miR-206共同介導的，而其對肥大的影響僅由miR-206介導[12]。有學者研究發(fā)現(xiàn)肥厚型心肌病患者的心臟標本、橫行主動脈縮窄(TAC)繼發(fā)性肥大反應期間的小鼠中YAP表達均增加，并且人的心肌細胞特異性YAP在體外和體內過度表達都誘導了肥大[13]。以上研究說明YAP在心肌肥厚過程發(fā)揮重要作用。

Hippo信號通路上游激酶的抑制或缺失可誘導YAP的核蓄積從而調控心肌肥大。在I/R損傷、心肌梗死和壓力過載時Mst1也被激活。Del Re等人研究發(fā)現(xiàn)Mst1的生理性激活劑Ras相關結構域家族1亞型A(Rassf1A)的升高與心肌細胞凋亡和心肌肥大相關，Rassf1A在小鼠心臟中的表達在1周時開始增加，但在12周TAC誘導心臟肥大后降低[14]。當心肌細胞特異性消融Rassf1a或過表達Mst1結合突變型Rassf1A時可減少TAC誘導的小鼠心肌肥大和纖維化[14]。上述結果說明Mst1是心肌肥大的負調控因子。Matsui等人發(fā)現(xiàn)， Lats2在小鼠壓力超載時也上調，但其過度表達并不影響心肌細胞凋亡，而是使心肌細胞減小[15]。心肌細胞特異性的顯性陰性形式Lats2(抑制內源性Lats2)的過度表達顯著增加心室肥厚并抑制TAC誘導的心肌細胞凋亡[15]。故Lats2也是心肌肥大的負調控因子。綜上所述，Hippo途徑及其各組分在調節(jié)心肌肥大方面發(fā)揮著重要作用。

3.2 缺血性心肌損傷與擴張型心肌病 缺血再灌注損傷是人類心功能不全最常見的原因之一。心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞的死亡在很大程度上是由于活性氧(ROS)的過度產(chǎn)生和細胞死亡途徑的激活所致。近年來Hippo信號通路在調節(jié)心肌細胞凋亡中的作用已被廣泛研究。Hippo通路的激酶Mst1在心肌細胞中可被兩種機制激活：白屈菜紅素通過caspase依賴的裂解激活Mst1，而calyculin A通過磷酸化激活全長形式的Mst1。當心臟出現(xiàn)I/R損傷時引起氧化應激通過上述兩種機制激活Mst1，Mst1被激活后在小鼠的心臟中特異性過度表達導致凋亡相關蛋白酶激活，進而出現(xiàn)心肌細胞凋亡增加、心臟擴張、心功能惡化，最終導致死亡。綜上所述，Mst1的激活與心肌細胞凋亡密切相關。

神經(jīng)纖維蛋白2(NF2)是一種GTP酶激活蛋白，調節(jié)RAS信號通路。據(jù)報道，在I/R損傷時NF2被激活從而可以調節(jié)Mst1和Lats2介導的心肌細胞凋亡[16]。杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)是一種進行性肌無力為主要表現(xiàn)的疾病，可引起擴張型心肌病、心力衰竭和心肌纖維化。DMD是由肌萎縮蛋白基因(MDX)的功能喪失或突變引起的。為了證明Hippo信號通路在擴張型心肌病中的作用，Morikawa等人構建了MDX單基因敲除和Sav1、MDX雙基因敲除的小鼠模型，并在形成擴張型心肌病超載模型后對它們進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)MDX單基因敲除小鼠心臟心肌細胞丟失，纖維化增加，發(fā)展成擴張型心肌病，且心臟功能受損。相反，在MDX基因敲除基礎上Hippo通路的失活(SAV1、MDX雙敲除)通過增加YAP活性來保護心臟免受擴張型心肌病的影響，從而增加心肌細胞增殖并減少凋亡[17]。

3.3 心律失常性心肌病 致心律失常性右室心肌病(ARVC)是一種原發(fā)性遺傳性心肌疾病，以右室心肌不同程度地被纖維脂肪組織替代為主要特征，往往伴有心室擴大、心力衰竭、嚴重惡性心律失常甚至猝死發(fā)生。Wnt/β-catenin信號通路調控心源性祖細胞向心肌細胞和脂肪細胞分化。Hippo通路在致心律失常性心肌病的人類心臟和小鼠模型中被激活。Chen等人研究發(fā)現(xiàn)在人類晚期致心律失常性心肌病患者中間盤蛋白的表達明顯降低，這些變化導致蛋白激酶C-α(pkcα)的定位減少，pkcα使NF2磷酸化并失活的作用減弱，因此，在致心律失常性心肌病的患者和臨床前小鼠模型的心臟樣本中可觀察到NF2的高表達[18]。NF2的激活導致Hippo成分Mst1/2，Lats1/2和Yap的磷酸化，抑制Yap-tead靶基因的表達。由于Wnt/β-catenin 和Hippo信號通路有交互作用，兩條通路中YAP, PG(γ-catenin)及β-catenin相互作用形成蛋白復來發(fā)揮作用，所以雖然總β-catenin水平?jīng)]有改變，但β-catenin在插入盤上的定位受到影響，導致Wnt/β-catenin轉錄活性降低[18]。綜上所述， Wnt/β-catenin激活和Hippo-Yap信號通路的降低與致心律失常性心肌病中心肌脂肪化有關。

3.4 心肌梗死后炎癥反應及心肌重塑 Hippo通路成分在心臟發(fā)育、再生和內穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用已被廣泛研究。最新進展表明，Hippo信號成分也參與調節(jié)炎癥過程，包括免疫反應。Hippo信號成分在調節(jié)不同病理生理學條件下的炎癥反應方面的作用已經(jīng)確立，但它們在調節(jié)MI后炎癥和重塑中的作用尚未得到充分研究。

研究表明，心肌梗死后心外膜重新激活，重新激活的心外膜細胞表達的基因通常為在胚胎時心外膜中表達的。這些心外膜細胞也會增殖并覆蓋受損組織。活化的心外膜細胞經(jīng)過EMT分化為成纖維細胞和平滑肌細胞，這進一步促進了修復過程。在心臟損傷時，心外膜也分泌血管生成因子和炎癥因子，從而增加炎癥細胞流入梗死區(qū)。Treg細胞已可降低損傷后心肌的免疫反應和梗死疤痕大小[19]。最近，Ramjee等人的研究表明，心外膜中的Hippo信號通路通過募集調節(jié)性T細胞(Treg)到受損心肌中，在心肌損傷后的恢復中發(fā)揮作用，由于在損傷心肌中Treg細胞數(shù)量減少，導致Yap和Taz的心外膜特異性缺失出現(xiàn)嚴重的損傷后心包炎和心室纖維化，進而導致心肌病發(fā)生率和死亡率增加。此外，YAP/TAZ還調節(jié)激活的心外膜中干擾素-γ的表達，當使用水凝膠外源性給予干擾素-γ時可改善Treg細胞向受損心肌的浸潤，并減少了心室纖維化[20]。盡管對Hippo信號在非免疫細胞相關炎癥反應中的作用進行了廣泛研究，但其在免疫細胞中的功能尚未建立[21]。這些結果表明，Hippo通路成分可能通過調節(jié)心肌梗死后的炎癥反應，控制不利的重塑、促進心肌梗死后心功能的恢復，在炎癥細胞中發(fā)揮著重要作用。

4 結論

Hippo信號通路已經(jīng)成為心臟發(fā)育、生長和損傷后再生/修復的重要調節(jié)因子。在動物模型中，刪除Hippo成分Sav1或激活YAP可改善心肌梗死后的心功能和心肌存活[22]。這表明Hippo信號通路有可能被用作促進心臟損傷后再生/修復的靶點。一些研究結果表明，長期的YAP激活可能對心臟產(chǎn)生不利影響[5]。這表明雖然YAP激活似乎有短期的有益影響，但其對Hippo信號通路和心臟損傷的長期后果仍有待闡明。需要嚴格控制心肌細胞中的YAP激活，以獲得改善損傷后心功能的有益效果，而不會產(chǎn)生重大不良反應。盡管Hippo信號通路在心肌細胞中已被廣泛研究，但其在藥物性心肌損害，如阿霉素心肌損害中未能得到很好的描述。阿霉素是目前療效最好的抗腫瘤藥物之一，其應用受到限制的主要原因就是心臟毒性，因此有必要進行進一步的研究，以更好地了解Hippo信號通路如何在開發(fā)無潛在副作用的治療干預中對它們進行調節(jié)。