生長因子納米載藥系統促進組織修復的研究

胡晨波，彭俊木，鐘偉洋，唐 可，權正學

（重慶醫科大學附屬第一醫院骨科，重慶 400016）

生長因子（growth factor）是一類作用于特定細胞表面的跨膜受體，可調節細胞增殖、遷移、分化等行為的蛋白質，對人體發育、代謝具有重大作用。研究表明[1-4]，生長因子在修復組織損傷，促進血管、骨骼甚至周圍神經等組織再生等方面同樣具有廣泛的生物學價值和應用前景。然而，現有的生長因子臨床應用與理論仍然存在巨大差距，首先，生長因子作為一種蛋白質，在體內半衰期較短，在體內蛋白酶的作用下，多種生長因子在進入體內后迅速失活；其次，直接攝取高劑量的生長因子對機體有一定的毒副作用[5-9]，成為生長因子類藥物應用推廣的“瓶頸”。納米載藥技術的出現，為克服生長因子臨床應用的局限提供了可能。通過基于各種人工合成的新型材料的納米載藥系統，生長因子能夠精準、持久地釋放于人體特定部位[10]。本文就納米載藥系統的概述及優越性、常見納米載藥材料的分類、生長因子納米載藥系統的應用及其不足及改進策略作一綜述

1 納米載藥系統的概述及優越性

納米載藥系統是粒徑在納米級的新型微小給藥系統的統稱，通過納米技術，以天然或合成的高分子材料作為載體，制成粒徑為1～100 nm 的藥物輸送系統，達到給藥的目的[11]。納米材料運載藥物的方式通常為藥物直接包載在納米載體的骨架中，或藥物通過共價連接修飾在納米載體表面[12]。對于多肽類或核酸類等容易被降解的藥物而言，納米載體不僅不會降解藥物或降低藥物活性[13]，且納米載體提供的理化屏障能保護載體中的藥物，減少其降解，延長其在體內的循環時間。同時，通過不同納米材料的自身性質及研究者為達到研究目的對載體的特定修飾，納米載藥系統能一定程度地控制藥物的在體內的濃度和分布[14]，是藥物控釋及靶向給藥未來的研究重要之一。納米復合物目前常用于治療骨缺損的研究，部分研究已經轉化為臨床應用，獲得了令人滿意的效果[15]。

2 常見納米載藥材料的分類

2.1 基于脂質體的載藥系統 脂質體（liposome）由親水親脂兩性分子模擬細胞膜結構構成，能夠包載不同形式的藥物，具有可降解、毒性低、生物相容性強等有點，自從1965 年Alec Bangham 及其同事描述了磷脂系統，Gregoriadis 首次提出脂質體可用于藥物在體內的運輸以來，脂質體載藥系統迅速成為了經典而常用的載藥系統[16]。利用生長因子類藥物作為運載藥物的實驗研究也證實了脂質體載藥系統的載藥性能。Shields LBE 等[17]利用122 只Wistar 大鼠，通過拔出其上頜牙，于牙槽中填充不同的物質，比較不同載藥材料對于大鼠牙槽骨缺損修復的影響，結果發現填充骨形態發生蛋白4 脂質體或填充TGF-β1的實驗組同期的骨小梁含量和血管數量均大于用PBS 作為填充的載藥材料的對照組，表明脂質體作為載藥材料運載生長因子能促進牙槽骨缺損的修復過程。Jeon S 等[18]將重組人表皮生長因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）包封入納米脂質體中，測量其經皮釋放性能，透射電鏡和顯微分析結果顯示粒徑約150 nm 的均質球形脂質體囊泡通過增強脂質體穿過皮膚毛孔，增強了重組人表皮生長因子在鼠皮膚中的滲透和定位。

然而，第一代脂質體對于部分藥物載藥率低下，藥物難以保留在脂質體中，且傳統的脂質體模型容易被肝、脾等部位的單核巨噬細胞系統攝取，減弱其治療效果。為此，科研工作者們進行了大量的研究改進脂質體作為載藥材料的性能[19-20]，如將聚乙二醇與脂質體連接等。近年來，刺激響應性脂質體獲得了科學界的關注。刺激響應性脂質體在體內循環到達靶向部位后，脂質體雙分子層結構或構型發生變化，釋放運載藥物，實現藥物的靶向釋放，提高藥物治療靶向效率，降低藥物不良反應[21]。以溫度刺激響應脂質體為例，在高于體內生理溫度的情況下，熱敏脂質體從凝膠態轉化為液晶態，脂質體滲透性大幅增加，運載藥物從脂質體中滲出，從而達到靶向載藥效果。基于此原理，二棕櫚酰磷脂酰膽堿（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）以其獨的熔融相變溫度（41.4 ℃）成為主要的熱敏脂質體的主要材料。在核磁共振的引導下，操作者可在檢測熱量聚焦和藥物濃集的同時，通過從外部調整聚焦溫度從而控制藥物釋放，在載藥領域有著廣泛應用前景[22]。一項以納米脂質體水凝膠運載bFGF 及牛血清白蛋白的研究顯示[23]，納米脂質體載藥系統的平均大小為232 nm，并具有58%的總蛋白包封率，并可增強人臍靜脈上皮細胞的增殖。脂質體納米載藥系統現存的主要問題是進一步提升載藥效率及克服不飽和脂肪酸脂質體在體內酶影響下解離。

2.2 基于固體脂質納米粒和納米結構脂質的藥物運載體系 固體脂質納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）以固相脂質為骨架，加入表面活性劑構成的藥物載體。常用的SLN 制備方法有高壓均質化、超聲均質化、高速均質化、溶劑乳化、超臨界流體乳膠萃取、蒸發或擴散等[24-26]。與傳統的脂質體載藥系統相比，SLN 載藥系統穩定性高，緩釋時間更長[27，28]。Silva AC 等[29]曾對一種SLN 系統開展長達2 年的研究發現，于生產時的94.9%的包封率相比，在25 ℃和4 ℃下貯存2 年后的SLN 系統包封率分別為91.9%和93.3%，僅有小幅下降，體現了SLN 系統的穩定性。自1991 年問世以來，基于不同的原理，各類SLN 載藥策略不斷被設計和研究，如抗體介導的SLN、磁性靶向SLN、pH 敏感型SLN、陽離子SLN 等[30]。以陽離子SLN 為例，Kuo YC 等[31]比較了搭配不同陽離子的肝素化SLN 納米微粒運載NGF的性能，不僅發現肝素和NGF 運載效率和納米微粒的膽固醇重量百分比增加而增加，與硬脂酰胺相比，以酯季銨鹽為陽離子的SLN 載藥系統具有更強的誘導多能干細胞生存能力，在神經分化過程中誘導多能干細胞膜電位的調控上具有客觀的研究前景。然而，由于主要結構為固體脂質，晶體結構也使SLN仍存在結合率較低、載藥量較小等缺點，同時不可預測的凝膠化趨勢也是SLN 值得關注的問題。

納米結構脂質體（nanostructured lipid carrier，NLC）即在SLN 基礎上在其固態的核心區域加入甘油后的改良體系，在載藥性能上繼承了SLN 的優點，同時載藥量更大，其中的液體成分防止了藥物在存貯過程中的排出，近年來研究表明NLC 能提高水溶性差的口服藥物的生物利用度，具有廣大的應用前景。有研究以甘油二酸酯和油酸以高壓均質化后制備得NLC，在將其用于運載西利馬林的體外實驗中，結果發現納米顆粒僅10 min 內即大量脂解，之后分為脂相、水相和沉淀相3 個階段，在水相中藥物大量溶解，從而提高了難溶口服藥物的生物利用度，這可能與脂質體分解后的消化產物和膽鹽混合而成的分子團有關，表明與益肝靈顆粒和傳統的西利馬林分散片相比，納米結構脂質體運載藥物的生物利用度分別提高了2.54 倍和3.10 倍[32]。盡管目前并無證據顯示NLC 比SLN 具有更低的生物毒性，目前為止，投入市場的NLC 產品數量也仍然有限[33]，但NLC 所具有的獨特優勢，使其值得在生長因子載藥中得到進一步的關注。

2.3 基于多聚物的納米藥物運載體系 高分子聚合物納米粒由自組裝的雙親聚合物組成。根據其性質分為天然高分子聚合物納米粒和合成高分子聚合物納米粒。常見的聚合物納米粒有殼聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸交酯（polyglycolide，PGA）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolicacid），PLGA]等。聚合物納米粒已在化療藥物載藥、疫苗載藥、基因藥物載藥方面得到長期應用，其中PLGA 作為一種新型人工合成的高分子聚合物，具有在生物體內可降解、藥物相容性好、降解產物毒副作用小等優點，已通過FDA 批準，成為納米載藥系最常用的材料之一。Chereddy KK 等[34]運用PLGA 運載血管內皮生長因子治療糖尿病小鼠，研究發現與單獨使用血管內皮生長因子相比，PLGA 納米微粒在mRNA 水平上調了VEGFR2 基因的表達，小鼠傷口肉芽腫形成過程中膠原蛋白更多，上皮化程度和血管生成程度更高，表現了PLGA 納米微粒在傷口愈合中的強大載藥潛力。另有研究表明[35]，一種含有帶正電荷的重組人bFGF 和帶負電荷的海藻酸鈉的多離子復合物PLGA 納米片，在相同促進小鼠傷口肉芽增生和血管生成的情況下，納米片的bFGF 處理劑量僅約為傳統噴霧治療所用bFGF 劑量的1/20。

殼聚糖是甲殼素脫乙酰基的衍生物，廣泛存在于甲殼動物的外殼和高等植物的細胞壁中，具有良好的生物相容性、生物可降解性，甚至抗菌活性[36]，既可以單獨運用于周圍神經系統的修復，也可作為多聚物材料以多種形式運用于藥物控釋。有研究將運載骨形態發生蛋白2 的殼聚糖-三聚磷酸酯（chitosan-tripolyphosphate）納米微粒覆蓋于鈦合金材料上，在體內和體外實驗中都檢測到了骨形態發生蛋白2 良好的生物活性[37]。除納米微粒外，殼聚糖還可以海綿、凝膠、薄膜、甚至支架等多種形式運用于藥物運載和組織工程[38，39]。然而，目前對于殼聚糖運載藥物的體內研究較少，同時，殼聚糖的制備多來源于甲殼類動物（如蝦、蟹、昆蟲）的外殼乙酰化。對殼聚糖提取純度、雜質種類及含量、安全性的要求尚缺乏統一標準，其制作方式也有改進的空間[31]。

2.4 基于蛋白質的納米藥物運載體系 蛋白質作為載藥材料的出現晚于脂質體和多聚物，但蛋白質納米微粒制備簡便，溶解產物為氨基酸，再利用性強，同時由于蛋白質微粒的帶電荷氨基酸多，可攜帶更多種類的蛋白質藥物。蛋白質納米微粒的載藥策略主要有自組裝和解溶劑化兩種方式。常用的蛋白質材料有白蛋白、乳球蛋白、魚精蛋白、白明膠、麩朊、豆球蛋白等，其中以白蛋白作為材料的載藥體系最引人關注。

Sun H 等[40]研究發現，卵清蛋白（ovalbumin）作為添加劑保護神經生長因子的性能要優于PEG、牛血清蛋白和葡萄糖；在體外實驗中，由于卵清蛋白的保護作用，實驗第10 天時神經生長因子能保持高于80%的活性，即使在28 d 后也能保持40%的活性。Zhang S 等[41]將聚乙烯亞胺覆蓋于牛白蛋白納米微粒上，結果發現聚乙烯亞胺可以控制骨形態發生蛋白從納米微粒中釋放，但并沒有促進新生骨形成及增加骨形態發生蛋白的運載量，但減少聚乙烯亞胺用量之后，骨形成效應增強，推測可能是聚乙烯亞胺在體內的積聚增強了納米微粒的毒性，影響了新骨的生成，而進一步優化納米載藥系統，可減輕聚乙烯亞胺的毒性作用。Zhang S 等[42]后續研究中將PEG與聚乙烯亞胺聯合覆蓋于牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)納米微粒上，與單純覆蓋聚乙烯亞胺的BSA 納米微粒對比，雖然7 d 后的藥代動力學檢測PEG-PEI 聯合覆蓋的納米微粒所剩余的骨形態發生蛋白2 較PEI 覆蓋的牛血清白蛋白納米微粒中骨形態發生蛋白2 剩余量低，但前者誘導新骨形成的作效應遠較后者明顯。Li L 等[43]以牛血清白蛋白為原料研發出納米粒子嵌入式電紡納米支架，用其運載骨形態發生蛋白2 和地塞米松，體外實驗可檢測到骨形態發生蛋白2 釋放時長可長達35 d，體內實驗顯示運用納米纖維支架的實驗組顱骨修復程度與空白對照組相比明顯提升。

2.5 其他用于納米載藥系統的生物材料 介孔二氧化硅（mesoporous silica）是一種無機材料，其顆粒結構穩定，生物相容性優良。自從Kresge CT 等[44]首次報道了M41S 有序介孔二氧化硅家族以來，介孔二氧化硅在載藥領域得到了日漸深入的研究。與其他載藥材料相比，介孔二氧化硅的主要優勢有：介孔二氧化硅的多孔結構，使其具有高比表面積，能攝取更多的藥物[45]；通過改變孔徑等參數或在其表面進行多聚物修飾等方法，可明顯改善藥物釋放的性能。但同時有研究表明二氧化硅顆?？梢鹦∈蟾闻K的炎癥、壞死等反應，甚至引起子代的并發癥，其中Yamashita K 等[46]將二氧化硅和二氧化鈦納米微粒靜脈注射入懷孕小鼠體內后，在胎盤及胎鼠的肝、腦中均發現了納米微粒，且經過納米微粒注射后的孕鼠子宮和胎鼠均較未經處理的對照組小鼠的子宮和胎盤小。Fu C 等[47]研究也發現，將注射的二氧化硅納米微粒的表面用氨基和羧基修飾后，上述毒副反應可以消失。以上研究都為進一步降低二氧化硅作為載藥材料的毒副作用提供了思路。

磁性材料為納米載藥系統設計提供了新思路?；诖判约{米微粒的載藥系統多以金屬或金屬氧化物為材料，可在體外磁場的作用下，到達特定靶器官或靶細胞，其特異性高，在影像診斷、組織工程、生物傳感等領域發展潛力巨大[48-51]。磁響應復合支架調控生長因子釋放的前景廣闊，甚至磁性材料可運用于組裝、構建復雜的組織結構[52，53]。在展現出如此強大性能的同時，以金屬氧化物為材料的納米微粒在體內作用產生的副反應也不容忽視，其在體內產生的活性氧可引起DNA 損傷、線粒體功能受損、染色體收縮、凋亡小體形成等一系列不良反應，對磁性納米微粒在機體內代謝、清除、免疫反應和毒性展開研究有助于預測納米毒性[51，54]。Wang Q 等[55]研究了聚丙烯酸（PAA）-鈷-3-（二乙胺）-丙胺（DEAPA）磁鐵礦納米粒子（PAMNPs）的生物特性，研究表明聚丙烯酸（PAA）-鈷-3-（二乙胺）-丙胺（DEAPA）磁鐵礦納米粒子主要分布在肝臟和血液中，在血漿中半衰期為3.77 h。在小鼠體內的實驗中，納米粒子可迅速代謝，且未引起任何毒性或不良反應[56，57]，提示磁性納米微粒表面包覆其他材料可能是一種可行的降低毒性的方法。目前，磁性納米材料在體外調控表皮組織、血管組織、骨骼肌組織甚至肝臟組織按照特定結構生長已經得到了滿意的結果[58]，磁性納米材料將是未來組織修復及組織工程中熱門材料之一。

3 生長因子納米載藥系統的應用-以骨組織修復重建為例

骨骼修復再生，是組織修復領域的熱點、難點[59]。骨不連是臨床上常見的疾病，創傷后的骨折不愈合增加了患者經濟負擔，給患者健康和生活帶來嚴重危害，因此骨不連的治療具有重要臨床意義。隨著目前臨床交鎖髓內釘、外固定支架、帶血管蒂骨瓣移植等治療骨不連的手術方式逐漸成熟[60]，對于骨組織的基礎研究，尤其是骨組織修復重建的研究成為新型骨不連治療方式的突破口。生長因子在骨骼修復重建過程中起到重要作用。骨折后，骨形態發生蛋白誘導骨骼生成，血管內皮細胞生長因子誘導骨折部位血管生成，而血小板衍生因子、轉化生長因子和β 成纖維細胞生長因子調控骨細胞增殖分化[61，62]。傳統的支架材料可提供良好的彈性模度，有利于細胞粘附，同時其多孔結構可促進細胞增殖，但難以調控細胞進一步分化。為提高生長因子藥物促進成骨的效率，降低不良反應，支架結合納米微粒組合成的生長因子載藥系統應運而生[63-65]。

目前關于促進成骨的納米載藥系統以運載BMP-2 為主，并且多以肝素作為穩定劑，但同樣有大量運用納米載藥系統運載自體間充質干細胞的研究[66-68]。Crasto GJ 等[69]研制出新型納米脂質體，該脂質體通過超聲刺激釋放BMP-2，將該脂質體裝入可吸收膠原海綿，一同植入小鼠股二頭肌中，經超聲刺激后，通過微量CT 及組織切片等方式，證實了納米載藥系統在體內良好的成骨活性及控釋過程中的安全性。Ma C 等[70]也利用自行設計的注射用納米微球纖維顆粒運載BMP-2 成功修復了大鼠顱骨缺損。

4 納米載藥系統的不足及改進策略

4.1 納米載藥系統運載生長因子類藥物目前問題 雖然目前的納米載藥材料研究取得一定進展，能解決傳統給藥途徑的部分缺陷，但用運載生長因子類藥物的納米載藥系統仍存在以下問題，如相關研究過少，現有大部分研究仍然主要聚焦于納米載藥材料在腫瘤診斷、治療領域的應用，將納米微粒用于運載生長因子類藥物的研究相對較少，尤其是各種新型納米材料，其性質尚處于研究階段，將其用于運載生長因子的相關研究則更少。同時，納米載藥系統本身尚存的不足也給新型載藥材料的應用帶來了挑戰。

目前所研究的納米微粒于體內具體作用機制仍不確切，具有潛在毒性、致癌性及致畸性，隨著納米微粒在體內生物聚集，其對于人體的風險可能隨之增加。除介孔二氧化硅以外，Knudsen KB 等[71]以小鼠作為研究對象，研究陽離子聚合物及脂質體納米微粒的毒性時發現，給小鼠靜脈注射陽離子膠束和脂質體后，小鼠肺、脾臟中的DNA 鏈斷裂明顯增加。目前國際上并無統一的納米材料對人體的風險評估標準[72]，因此納米材料的安全性尚需更多理論依據、實驗數據及循證醫學證據以進行評估。

此外，納米微粒作用于生物體內的過程中仍然普遍存在靶器官靶組織內濃度不高等問題。多項體外研究表明大多數納米微粒直徑在10～60 nm 時，表現出最大的細胞攝入量。在生物機體內部，情況則更為復雜，一方面直徑過?。ǎ?0 nm）的納米微粒容易被腎臟的濾過屏障濾過并隨尿排出，難以在生物體內特定區域聚集，而直徑過大的納米微粒（＞200 nm）則會激活補體系統，沉積在肝臟和脾臟中[73]。因此，在未能完全保證納米藥物的安全性之前，目前納米材料運載生長因子的研究體外實驗占多數，大多數體內研究也局限于動物實驗模型階段[74]，且臨床試驗可能得到與動物實驗不完全一致的結果[75]。

4.2 納米載藥系統的改進策略 面對現今納米材料臨床應用的局限性，新型納米材料的設計，尤其是納米材料相關性質的研究或將成為改變現狀的突破口。隨著材料學不斷的發展，納米微粒的設計和修飾受到越來越多學者的關注。即使是同一納米材料，通過改變其大小、形狀等性質，也會有不同的生物效應。細絲狀的納米多聚物分子團在循環中的有效期可長達多于1 周，遠高于與之對比的球狀納米微粒的有效期[76]（2～3 d）。而將傳統的納米載藥系統加以修飾，也可顯著提高納米微粒的性能[77]。多種材料聯合應用也是納米載藥系統的改進策略之一。利用多種納米材料的特性，可以克服單一納米材料的不足，有極大的研究價值及可行性，目前已經在動物實驗中獲得了滿意的效結果[78-80]。

5 總結

納米載藥系統延長了藥物在體內的作用時間，調控了藥物在體內特定器官及組織釋放，達到了藥物緩釋劑靶向載藥的目的，且新型納米載藥系統的研發也取得了眾多成果。但延長藥物在體內循環時間、實現特定部位靶向聚集只是新型納米載藥材料所需特性的一部分，將載藥材料轉化為臨床成果更需考慮材料學、醫學、經濟學等各方面因素。未來，進一步研究納米材料在不同組織中作用效率的差異，探究生長因子修復組織的分子機制也將為生長因子載藥體系的構建提供新的思路，從而為損傷修復和組織再生提供新工具、新方法。