天然免疫在非酒精性脂肪性肝病中的作用研究進展

李威，夏豪

(武漢大學人民醫院心血管內科，武漢 430060)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種在全球范圍內高度流行的慢性肝病。據報道，全球成年人NAFLD的患病率約為25%，且多合并有肥胖癥、糖尿病、代謝綜合征等代謝紊亂疾病[1]。NAFLD的發病機制尚不十分清楚，有學者提出“二次打擊”假說[2]，但目前認為NAFLD的發病及進展是一個多因素復雜過程，肥胖癥、胰島素抵抗以及腸道微生物穩態紊亂導致的炎癥激活、代謝紊亂在NAFLD的疾病進展過程中起著關鍵作用[3]。盡管目前對NAFLD病理機制的研究取得了一定進展，但臨床仍缺乏有效延緩和逆轉慢性炎癥導致肝臟實質性損傷的藥物[4]。天然免疫為非特異性的宿主防御反應，越來越多的證據顯示，天然免疫在代謝紊亂、炎癥以及纖維化的調控中具有重要作用，同時也是NAFLD進展的驅動力[5-8]。隨著研究的深入，天然免疫信號網絡中的一些重要分子靶標可能成為NAFLD治療的新靶點。現就天然免疫信號網絡在NAFLD中的調控機制進行綜述。

1 肝臟的天然免疫系統

肝臟是人體內功能最復雜的器官，血液循環豐富。與其他器官的動脈供血不同，3/4的肝臟血供來源于由胃、腸、脾、胰等臟器靜脈匯集而成的門靜脈，其中包含了大量來自腸道的微生物相關分子模式、病原相關分子模式以及各種毒素和抗原分子[9-10]。豐富的血液供應和獨特的循環結構使肝臟內存在著強大的免疫網絡，大量易位病原體可通過門靜脈直接流向肝臟，但并不會引起全身感染，說明肝臟具有強大的免疫系統能夠識別并清除這些病原微生物[11]。在生理條件下，肝臟的免疫耐受能有效防止免疫系統的過度激活，但當腸道微生物菌群失調、腸壁完整性受損時，大量腸道微生物及毒性產物移位至肝臟，根據肝臟的血流動力學特點，這些腸源性微生物、毒素產物流經肝血竇時破壞肝臟的天然免疫穩態，導致免疫系統過度激活，引起炎癥、纖維化以及代謝紊亂等，導致肝實質細胞損傷[9-10,12]。

肝臟不僅是一個代謝器官，也是一個重要的免疫器官。一些重要的天然免疫細胞(如庫普弗細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞、中性粒細胞以及肥大細胞)與同樣具有免疫功能的肝細胞和肝血竇內皮細胞共同組成肝臟的天然免疫細胞網絡[6]。生理條件下，天然免疫網絡處于協調穩態，當肥胖、胰島素抵抗或代謝綜合征等代謝紊亂導致肝臟的代謝失衡時，肝細胞內脂質過度堆積導致的脂毒性可激活肝細胞的免疫反應及炎癥應答。同時，腸-肝微生物軸穩態的破壞造成腸道微生物及毒性產物移位，使肝內天然免疫過度活化，進一步促進肝細胞啟動炎癥、凋亡、自噬、纖維化等過程，加重非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)的進展，最終導致肝硬化甚至肝癌[8]。綜上，天然免疫信號網絡調節紊亂、細胞內天然免疫信號通路過度激活、炎癥和脂質代謝調節紊亂是NAFLD進展的重要原因。因此，了解代謝應激條件下肝臟中天然免疫信號的調控機制對于NAFLD的防治有重要意義。

2 NAFLD中的天然免疫信號通路

脂質代謝紊亂導致的代謝應激是NAFLD最直接的病因，而代謝應激誘導的炎癥由天然免疫系統驅動。駐留在肝臟的天然免疫細胞以及肝細胞和肝血竇內皮細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)感知持續產生的損傷相關分子模式和代謝產物，觸發一系列天然免疫信號通路，產生多種加重慢性炎癥、脂質代謝紊亂的效應分子，從而加重NAFLD的疾病進展[13-14]。

2.1PRR 在代謝壓力下，肝內PRR過度激活在NAFLD的發生發展過程中起重要作用。隨著營養過剩導致的代謝壓力增大，大量脂質分子在肝內堆積，脂毒性導致肝實質細胞線粒體損傷、內質網應激以及自噬等一系列過程，肝細胞凋亡或壞死釋放大量的損傷相關分子模式，從而導致肝內PRR過度激活，天然免疫平衡遭到破壞[15]。

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是目前研究最為深入的天然免疫PRR。TLR1、2、4、5和6定位在細胞膜表面，能夠識別并結合不同病原體表面的病原相關分子模式；而TLR3、TLR7～13在細胞內質膜上被發現[16]。TLR的結構及定位決定了其PRR的功能，如經典的TLR4通路可以識別革蘭陰性菌的脂多糖，并激活一系列的信號轉導通路，從而激活炎癥、免疫應答。TLR是一種Ⅰ型跨膜蛋白，包含定位于細胞外的富亮氨酸重復域和跨膜域以及定位于胞質的Toll/白細胞介素-1R(Toll/interleukin-1 receptor，TIR)域，前者的主要功能是胞外信號識別和細胞膜定位，TIR域的主要作用是信號轉導[17]。研究表明，TLR參與正向或負向調控NASH進展，其中TLR2、TLR4、TLR9敲除小鼠的肝細胞脂肪變性、炎癥以及胰島素抵抗減輕，而TLR5敲除小鼠則表現出對NASH敏感性增加[18]。Mridha等[19]的研究發現，TLR9在NASH患者和NASH小鼠中表達上調，TLR9敲除小鼠的高脂飲食導致的脂肪肝和代謝性炎癥明顯改善，這可能是通過抑制M1型巨噬細胞極化和中性粒細胞趨化發揮作用。綜上，靶向TLR受體以干擾相關的代謝性炎癥激活有望成為一種有效地改善NASH病理過程的治療手段。

其他家族的PRR亦有報道能調控NASH的發生發展。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體主要位于胞質，在代謝壓力下，核苷酸結合寡聚化結構域1激活可誘導下游促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路活化、核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)活化，同時通過增加趨化因子CC趨化因子配體5和CXC趨化因子配體1的表達促進炎癥反應[20]。核苷酸結合寡聚化結構域2不能單獨激活炎癥，但可協同TLR通路共同激活炎癥[21]。Wree等[22]研究表明，敲除小鼠的核苷酸結合寡聚化結構域3能改善膽堿缺乏飲食誘導的肝損傷、炎癥以及肝纖維化。PRR作為天然免疫信號激活的起始部分，感知脂質應激和代謝紊亂產生的損傷相關分子模式和代謝產物等的刺激后過度激活，并通過一系列細胞內和細胞間信號級聯反應引起持續性的慢性炎癥損傷，從而導致NASH的發生發展以及各種肝外并發癥的產生。因此，干擾天然免疫信號的過度激活和信號轉導可能對NASH和肝外并發癥的預防和治療有一定意義。

2.2銜接蛋白 當代謝壓力導致PRR過度活化后，信號轉導作用將PRR接收到的信號轉導給下游的激酶信號級聯，從而調控多種促炎因子和脂質代謝相關轉錄因子的轉錄，產生各種調控炎癥以及脂質代謝的效應分子。部分銜接蛋白充當信號傳遞伴侶蛋白的作用。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)C端的TIR域可與TLR相互作用，N端的DD域是人白細胞介素受體相關激酶家族識別并結合的同源域，通過蛋白相互作用將TLR接收的信號轉導至下游，磷酸化激活人白細胞介素受體相關激酶并激活下游信號轉導[23]。含有TIR域的銜接子誘導β干擾素(TIR domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF)也是天然免疫中的一種重要銜接蛋白，在MyD88依賴的TLR3通路中起重要作用[24]。Yamamoto等[25]研究表明，TRIF與MyD88同時敲除小鼠受到TLR4配體相應刺激后無法激活下游NF-κB通路。TRIF相關接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)是一個包含TIR域的接頭蛋白，在天然免疫信號轉導中具有重要作用。敲除TRAM基因能特異性阻斷TLR4介導的下游信號通路激活以及細胞因子的釋放[26]。

2.3信號轉導相關蛋白激酶 在NAFLD代謝紊亂環境下，PRR持續激活，隨后一系列與炎癥脂質相關的信號通路被激活。在MyD88、TRAM、TRIF等銜接蛋白的轉導下，腫瘤壞死因子受體相關因子家族(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)作為泛素E3連接酶家族，參與信號轉導，通過泛素化修飾底物蛋白，招募并激活一些天然免疫信號通路中的重要激酶[27]。TRAF對于炎癥、代謝的調控作用依賴于其本身的E3連接酶屬性[28-30]。TRAF能接收代謝性壓力導致的受體激活信號，并介導一些關鍵蛋白激酶的磷酸化，從而啟動信號轉導和信號級聯過程。

MAPK家族包括p38、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、胞外信號調節激酶及上游的MAPK激酶和MAPK激酶激酶。凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)是MAPK激酶激酶家族成員之一，該激酶在活性氧類、代謝壓力以及各種細胞因子刺激下激活并同時激活下游的MAPK。研究發現，NASH患者體內ASK1過度活化，TRAF1、TRAF6等E3泛素連接酶可靶向促進ASK1的泛素化修飾，進而促進ASK1活化，加重NASH疾病進展[29-30]。轉化生長因子-β活化激酶1(transforming growth factor-β activated kinase 1，TAK1)也是MAPK激酶激酶家族成員之一。TAK1被泛素化激活后，下游的JNK/p38也相應被激活，加重炎癥損傷和代謝紊亂過程[28,31]。通過去泛素化或去磷酸化抑制TAK1的活化可抑制NASH的進展。據報道，泛素特異性蛋白酶18可通過去泛素化修飾TAK1抑制TAK1的活化，下調JNK/p38通路可顯著改善NASH小鼠肝細胞炎癥和胰島素抵抗[32]。由此可見，在代謝性應激誘導的MAPK通路活化過程中，蛋白翻譯后泛素化和去泛素化修飾共同調控蛋白激酶的磷酸化，調控這些蛋白翻譯后修飾的關鍵酶可能是NASH炎癥進展過程的重要分子開關。

NF-κB通路在動物或細胞NASH模型中均處于過度激活狀態，與代謝紊亂導致的慢性炎癥密切相關[33]。Dong等[34]用棕櫚酸體外刺激原代肝星狀細胞模擬脂肪酸代謝紊亂發現，TLR4-NF-κB信號通路被激活，且肝星狀細胞中的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體活化。在高脂喂養誘導的NASH小鼠模型中，抑制TAK1-NF-κB激酶抑制劑/NF-κB信號通路可明顯改善小鼠的肝脂肪變性、炎癥和氧化應激[35]。

在脂質代謝紊亂、慢性炎癥過度激活PRR、調控炎癥脂質的效應分子產生的過程中，細胞內的信號轉導和信號級聯起到至關重要的作用，一些關鍵性的銜接蛋白和激酶有望成為新興的治療靶點。

2.4轉錄因子 轉錄因子位于細胞內信號通路的最下游，可以調控多種脂質代謝和炎癥相關的細胞因子的表達以及釋放。干擾素調節因子(interferon regulatory factor，IRF)主要參與Ⅰ型干擾素和干擾素誘導型基因的表達調控，是宿主防御機制的重要組成部分[36]。IRF在代謝性疾病中也發揮著重要作用。研究顯示，在高脂飲食喂養的NASH小鼠模型中，IRF3通過抑制NF-κB激酶抑制劑/NF-κB信號通路轉導減輕肝臟炎癥、脂肪變性和胰島素抵抗[37]。Wang等[38]的研究發現，IRF3的同家族成員IRF7在高脂喂養模型中能促進NASH的炎癥激活及脂質代謝紊亂，而IRF敲除小鼠用高脂飲食喂養后，肥胖相關的代謝紊亂和胰島素抵抗明顯減輕，提示IRF同家族成員在調控NASH疾病進展過程中可能發揮不同的作用。深入研究并明確IRF家族不同分子在NASH調控中的作用，對后期臨床靶向藥物的研發至關重要。

NF-κB轉錄因子與炎癥和代謝調控密切相關，TLR激活后通過一系列信號轉導激活NF-κB激酶抑制劑/NF-κB通路，導致多種脂質和炎癥基因上調，促進飲食誘導的胰島素抵抗，同時加重肥胖和胰島素抵抗導致的慢性炎癥，更進一步促進NAFLD以及各種代謝性疾病的進展[39]。NF-κB通路與炎癥反應激活密切相關，在NAFLD中，過度炎癥激活導致的肝細胞不可逆性損傷是單純性脂肪肝進展為NASH的重要條件。因此，靶向抑制NF-κB通路，減少相關促炎因子的轉錄表達，有可能延緩單純性脂肪肝向NASH的疾病進程。

3 天然免疫與NAFLD治療

調整飲食和運動仍是NAFLD的主要治療方式。低熱量飲食結合中等強度的運動是減輕體重和控制肝脂肪變性的最佳策略，但能否改善肝臟的炎癥和纖維化仍不確定[40]。天然免疫中的一些關鍵信號分子有望成為治療NAFLD的有效靶點。

ASK1是MAPK激酶信號級聯中的一個重要激酶，同時也是天然免疫調控代謝性炎癥的一個關鍵信號分子。在脂質代謝紊亂的環境下，ASK1激活并驅動下游的JNK/p38通路激活，進一步加重代謝性炎癥、細胞凋亡和纖維化，促進NASH甚至肝纖維化進展。ASK1成為NASH藥物研發的主要靶點之一，Selonsertib(GS-4997)是一種小分子ASK1選擇性抑制劑，能夠改善NAFLDⅡ期患者的肝炎和肝硬化[41]，但Selonsertib的Ⅲ期臨床試驗未成功。MAPK激酶激酶家族成員TAK1亦在代謝應激條件下被激活，代謝應激誘導的泛素化蛋白修飾和自磷酸化激活是TAK1激活的必要條件，通過去泛素化或去磷酸化抑制TAK1的過度活化可能是治療NASH的可行策略之一。去泛素化酶圓柱瘤蛋白可通過與TAK1直接作用并移除TAK1的K63連接的多聚泛素化鏈，有效阻止下游JNK/p38通路的激活，從而改善高脂喂養NASH小鼠和猴體內的脂質蓄積、胰島素抵抗、炎癥和纖維化[42]。臨床前研究已證實，抑制ASK1和TAK1的過度激活可有效抑制NASH的進展[30-31]，但關于ASK1和TAK1抑制劑的臨床轉化仍需要更多有效臨床研究的證實。

4 小 結

天然免疫與NAFLD密切相關。了解天然免疫信號網絡的性質和復雜性，可為NASH新療法的合理設計開辟新的途徑。NAFLD作為一種復雜的代謝性疾病，肝臟疾病不同進展階段(單純脂肪變性、NASH、肝硬化、肝癌)的組織學表現和分子機制不同，目前導致疾病進展的驅動機制尚未完全闡明。天然免疫信號網絡在NAFLD各個病理階段均發揮關鍵作用，靶向天然免疫信號網絡中的一些關鍵分子在臨床前研究中取得了一定成效。因此，需要深入探索NAFLD的潛在病理機制以及天然免疫信號網絡在NAFLD各個階段中的作用，以為NAFLD的預防和治療提供新策略。