饑餓脅迫下劍尾魚肝臟代謝組學研究

張彥坤，楊兵坤，李航宇，胡林勇，趙新全，徐世曉，孫平*

(1.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽471003；2.中國科學院西北高原生物研究所，西寧810008)

魚類除了在胚胎時期能夠依靠卵黃或者母體提供的營養生存之外，其余各生活階段都必須從外界環境中獲取食物或能量，當無法從外界獲取足夠的食物時，其生存、生長、繁殖、甚至后代都會受到影響(宋昭彬，何學福，1998)。自然界中因季節變化、洄游、生存環境惡化，甚至在人工養殖中飼料投喂不均勻導致的魚類短期饑餓現象十分普遍(Hungetal.，1997；Barcellosetal.，2010；Bar，2014)，更是導致幼、稚魚高死亡率的重要因素之一。因此，魚類通過組織學、行為和生理生化活動的改變，如激素的分泌、與能量維持相關的基因表達以及酶激活等方式以降低代謝、延長能量儲備滿足新陳代謝需要的時間應對饑餓脅迫(Parketal.，2012；覃川杰等，2015)。

饑餓脅迫會對魚類的腸道、肝臟等組織產生諸多不利影響，譬如減少腸道長度(Riosetal.，2004)和細胞數量、腸褶和刷狀邊界長度，導致腸道肌纖維排列松散、腸道絨毛受損等(Sire & Vernier，1992)；肝臟組織喪失連續性和致密性、肝細胞和細胞核變小，核仁丟失，線粒體增大，胞間層空隙變大，細胞質嚴重崩潰；降低胃黏膜皺褶高度、黏膜下層厚度、上皮細胞高度及胃腺厚度(付世建等，1999；Huretal.，2006；Zengetal.，2012；Sakyietal.，2020；Fanetal.，2021)。另外，饑餓會引起魚類生理顯著變化，造成肝臟氧化應激，同時腸道中關于超氧化物歧化酶和過氧化氫酶含量發生變化導致組織損傷(Bhattacharyyaetal.，2014；Peteretal.，2020)，為了應對饑餓環境和產生的氧化應激，魚類細胞會通過自噬產生氨基酸、核苷酸和脂肪酸產物來維持正常的代謝，從而適應饑餓脅迫(Talloczyetal.，2002)。在腸道微生物方面，饑餓會導致魚類腸道中微生物菌群大量死亡(Kohletal.，2014)，進而影響消化酶的活性(Lietal.，2019)，也會導致免疫屏障受到影響(Alonsoetal.，2019)，這種現象在大西洋鮭Salmosalar(Martinetal.，2010)、草魚Ctenopharyngodonidellus(Tranetal.，2018)、虹鱒Oncorhynchusmykiss(Soltanian & Gholamhosseini，2019)和雜交石斑Epinephelusfuscoguttatus×E.lanceolatus(Liuetal.，2020)中都存在。

劍尾魚Xiphophorushelleri是一種小型、強壯、易喂養的卵胎生花鳉科Cyprinodontidae魚類，具備繁殖世代時間短(1～1.5個月)、雌雄易區分、對環境變化敏感、性情溫順、顏色靚麗、便于在實驗室條件下進行純化培養等特點，已被用作水生實驗動物的模式生物，具有廣闊的發展前景，近年來養殖規模逐漸擴大(吳淑勤等，2005；Han & Fang，2010)。饑餓脅迫過去已被研究，但是隨著組學技術的發展，其對魚類的影響有待進一步發掘，代謝組學技術可以檢測饑餓對魚類肝臟中小分子代謝物的影響，隨后利用生物信息學探討饑餓對魚類肝臟的影響。本實驗旨在通過代謝組學技術，研究劍尾魚在面對饑餓脅迫時，肝臟中受影響較大的代謝物與相關的代謝通路，闡明饑餓脅迫對魚類肝臟代謝物層面的影響，為了解饑餓脅迫對魚類肝臟代謝組的影響及其小分子代謝物調節機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

實驗儀器：Triple TOF 5600+質譜儀(AB SCIEX)，色譜：Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(Agilent)。色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column。

試劑：乙腈(Merck，1499230-935)、乙酸銨(Sigma，70221)、甲醇(Merck，144282)、氨水(Merck，105426)，所有實驗試劑均為分析級或HPLC級。

1.2 實驗動物

本次實驗動物為雄性紅劍尾魚，購于陜西紅劍尾魚養殖基地。選擇5月齡、規格相近、體表無傷痕、鱗片完整、體色鮮艷且體質健壯的紅劍尾魚作為實驗魚。在正式實驗前，將劍尾魚進行為期2周的馴化，水溫(26±0.5)℃，溶解氧≥5 mg·L-1，24 h曝氣，14 h光/10 h暗周期，每天投喂2次(09∶00和 17∶00)，投喂寸金牌商品飼料，每天投喂量為魚體質量的3%，每3天更換1次水。

1.3 實驗設計

2周馴化結束后，將體長和體質量相近的劍尾魚隨機分為對照組和饑餓組，每組24尾，稱量初始體質量。每3天換1次水，為避免個體間攻擊行為的影響，每條魚單獨飼養，每個養殖單元長10 cm×寬15 cm×高10 cm，水深8 cm(圖1)。對照組在實驗期間正常喂養，投喂量和投喂時間與馴化期相同，饑餓組在實驗期間連續14 d禁食。實驗環境水溫、光周期等環境與馴化環境相同。14 d后，再次稱量實驗魚的體質量，然后使用MS-222魚用麻醉劑麻醉，在超凈工作臺內用蒸餾水沖洗魚體 3次后置于冰上解剖，取肝臟置于液氮中保存，實驗結束后，組內隨機選取4尾魚的肝臟樣品混合為1個肝臟樣本，每組6個肝臟樣本。

1.4 代謝物提取與液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS)分析

取肝臟樣本在液氮中研磨，每樣稱取100 mg，加入200 μL預冷水和800 μL預冷的甲醛/乙腈(1∶1，v/v)，混勻，冰浴中超聲60 min，-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白，16 000 r·min-14 ℃離心20 min，取上清。上清在高速真空濃縮離心機揮發干。質譜檢測時加入100 μL乙腈-水溶液(1∶1，v/v)復溶，14 000 r·min-14 ℃離心15 min，取上清液進樣分析。

整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中，樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(UHPLC)使用HILIC色譜柱進行分離，進樣量為5 μL，柱溫為25 ℃，流速0.3 mL·min-1；色譜流動相A：水+25 mmol·L-1乙酸銨+25 mmol·L-1氨水，B：乙腈；色譜梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95%乙腈；0.5～7 min，乙腈從95%線性變化至65%；7～9 min，乙腈從65%線性變化至40%；9～10 min，乙腈維持在40%；10～11.1 min，乙腈從40%線性變化至95%；11.1～16 min，乙腈維持在95%。樣本隊列中插入QC樣品，用于監測和評價系統的穩定性及實驗數據的可靠性。每例樣品分別采用電噴霧電離(ESI)進行正離子和負離子模式檢測。樣品經UPLC分離后用Triple-TOF 5600質譜儀(AB SCIEX)進行質譜分析。

1.5 數據預處理與代謝物識別

原始數據經Abf Converter轉換成abf格式，然后采用MSDIAL程序中的XCMS進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。代謝物結構鑒定采用精確質量數匹配(<25 ppm)和二級譜圖匹配的方式，檢索MassBank公共數據庫。對提取得到的數據，刪除組內缺失值>50%的離子峰，整合正負離子峰并應用SIMCA-P14.1進行模式識別，數據經歸一化預處理后，進行多維統計分析，包括無監督主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。

2 結果

2.1 饑餓前后劍尾魚體質量變化

重復測量方差分析結果表明，實驗前后對照組體質量的差異極顯著(F1，10=321.448，P<0.001)；實驗前后饑餓組體質量的差異極顯著(F1，11=490.797，P<0.001)；實驗后2組之間的差異極顯著(F1，10=843.779，P<0.001)(圖2)。

2.2 樣本原始數據處理與主成分分析

PCA分析結果顯示，對照組與饑餓組在空間中均完全分開，說明在代謝水平上可以發現饑餓對肝臟代謝物的代謝模式產生了影響(圖3:a)。對照組與饑餓組之間的OPLS-DA分析結果顯示，OPLS-DA的具體模型參數為R2=0.945，Q2=0.735，R2、Q2>0.5表明模型穩定可靠，未發生過擬合現象(圖3:b)，表明2組之間的代謝物具有明顯差異，可進行下一步分析。實驗中所有數據均處于95%置信區間內。

2.3 差異代謝物的篩選

利用LC-MS分析對照組與饑餓組樣品在正離子和負離子模式下的代謝物組成，共采集到 13 842個代謝峰，其中正離子模式采集到10 317個，負離子模式采集到3 525個，基于OPLS-DA模型中的VIP值進行差異代謝物的篩選，選取VIP>1的代謝物作為差異的代謝物，共篩選出 5 558種差異代謝物，3 119種上調，2 439種下調，通過單變量分析方法繪制2組肝臟樣本間差異代謝物的火山圖(圖4)，隨后選擇FC>2或FC<0.5，且P<0.05作為篩選標準選出具有明顯差異的代謝物，共篩選出103種代謝物擁有具體的代謝通路，在此基礎上構建差異代謝物并進行聚類分析(圖5)，結果表明，共有40種代謝物表達上調，63種代謝物表達下調。

2.4 差異代謝物的代謝通路分析

為了確定受到饑餓脅迫干擾的生物途徑，使用KEGG數據庫(https://www.kegg.jp/)將饑餓組與對照組比較后得到的顯著性差異代謝物進行KEGG代謝通路富集(圖6)。挑選10條顯著性差異代謝物富集最多的代謝通路制成氣泡圖，分別是牛磺酸和亞牛磺酸代謝(3種代謝物)、淀粉和蔗糖代謝(6種代謝物)、嘌呤代謝(5種代謝物)、半乳糖代謝(6種代謝物)、FoxO信號通路(2種代謝物)、不飽和脂肪酸的生物合成(5種代謝物)、氨基酸的生物合成(6種代謝物)、氨基酰基-核糖核酸的生物合成(4種代謝物)、氨基糖和核苷酸糖代謝(6種代謝物)和ABC轉運蛋白(13種代謝物)。

2.5 顯著性差異代謝物與代謝通路

根據參與富集排名前10的代謝通路的代謝物篩選出8種代謝物：D-甘露糖、α-D-半乳糖、蔗糖、亞油酸、L-精氨酸、D-葡萄糖、牛磺酸和脫氧肌苷，分別參與8條代謝通路(表1)。

表1 饑餓后劍尾魚肝臟中的顯著性差異代謝物

2.6 代謝通路分析

在篩選出具體的顯著性差異代謝物之后，通過KEGG網站代謝通路中物質的變化來尋找代謝通路間的關系，可以看出饑餓后的劍尾魚肝臟半乳糖代謝中半乳糖表達下調后影響了氨基糖和核苷酸糖代謝中的α-D-半乳糖，進而導致UDP-D-葡萄糖表達的下調影響到淀粉和蔗糖代謝(圖7)。

3 討論

本實驗選擇劍尾魚作為實驗動物，通過代謝組學技術研究饑餓對其肝臟代謝的影響。因為可以識別特定代謝通路的紊亂與否，代謝組學方法比傳統參數(如魚類健康的生理參數或生化標記)更敏感，反應比傳統生物標記更具生物學意義(Longetal.，2020)。從篩選出的重要差異代謝物和KEGG通路富集分析的結果看，饑餓脅迫影響了劍尾魚肝臟中的FoxO通路、糖代謝、脂肪代謝和氨基酸代謝。

劍尾魚遭受饑餓脅迫后，肝臟中糖類物質如D-甘露糖、α-D-半乳糖、D-葡萄糖以及蔗糖顯著下調，這個結果與其他學者的結果相同(Jiaoetal.，2020)。此外，在通路富集結果中發現饑餓影響了FoxO信號通路，FoxO信號通路與多種生物學過程有關，包括細胞代謝(Halletal.，2000)、免疫和抗氧化應激(van Der Heideetal.，2004；Balabanetal.，2005)。在饑餓脅迫下，FoxO對促進糖異生酶的表達具有關鍵作用，同時參與促進碳水化合物向脂肪酸的轉變，據此推測持續14 d的饑餓過程中，劍尾魚依靠肝臟中糖異生提供能量。在氧化應激方面FoxO信號通路可以驅動參與對抗氧化應激的基因的表達，從而保護細胞功能(Grossetal.，2008)，Gao等(2019)在對斑點叉尾Ictaluruspunctatus的研究表明，FoxO在對細菌感染的免疫應答中發揮重要作用。肝臟內環境的穩態涉及多種物質和細胞共同調節，糖類代謝物D-甘露糖作為免疫蛋白的合成物質之一，對生物體的健康和免疫功能具有重要的意義(van Immerseeletal.，2002；Berge & Wierup，2012；Jenne & Kubes，2013)。饑餓脅迫導致劍尾魚肝臟中的D-甘露糖表達極顯著下調，可能會導致機體對環境中其他的脅迫如炎癥、受傷、免疫以及對不良病菌的適應性和抵抗性降低，其中肝臟炎癥和免疫被視為一個高度復雜的動態反應網絡，營養代謝物的變化會影響適應性免疫(Humphrey & Klasing，2004；Robinsonetal.，2016)。有研究表明，在面對環境脅迫導致的免疫力降低時，魚類會增加自身的免疫物質來應對環境脅迫，如鯽魚Carassiusauratus在面對重金屬錳污染時，會增加體內的皮質醇來增加自身的適應性(Alikoetal.，2018)，類似的情況在大西洋鮭Salmosalar中也有出現(Fastetal.，2008)。本實驗發現，饑餓后的劍尾魚肝臟中亞油酸的表達顯著上調。推測可能是饑餓脅迫發生后，魚體肝臟細胞通過自噬來獲取營養，而亞油酸是組成細胞膜磷脂的重要成分(馬宏峰，2007)，膜的分解最終導致了亞油酸表達上調。饑餓后亞油酸在肝臟中的顯著上調是為了彌補與免疫相關的糖類物質的顯著下調，維持機體的正常免疫與抗炎癥系統，但饑餓脅迫后魚類的免疫能力是否下降仍需要進一步驗證。

饑餓脅迫后，劍尾魚肝臟中的L-精氨酸和牛磺酸表達顯著下調。精氨酸作為魚類機體細胞內功能最多的必需氨基酸之一，其代謝產物在動物機體能量與脂肪代謝具有重要作用，同時精氨酸可在魚體內生成NO，參與魚類免疫功能調節(萬軍利等，2006；韓鳳祿等，2016；王瑩等，2017)。牛磺酸是魚類生長發育必不可少的物質(石立冬等，2020)，具有增強免疫力和抗氧化能力(田芊芊等，2016)。劍尾魚肝臟中精氨酸和牛磺酸顯著下調，可能是經過14 d饑餓脅迫并消耗大量糖類和脂肪之后開始消耗氨基酸進行供能，這些氨基酸代謝物的下調和與免疫相關的糖類下調均會影響魚類的免疫和抗氧化能力，但是亞油酸的上調說明魚類的免疫調節系統并未因為饑餓脅迫完全喪失。營養和免疫之間的作用是多種多樣的，無法獲得營養會損害肝臟的保護性免疫(Humphrey & Klasing，2004)，因此，推測饑餓脅迫會損害劍尾魚肝臟的免疫功能。但仍需要進一步通過免疫學實驗觀察肝臟內相關的免疫因子或免疫細胞的變化來驗證饑餓脅迫對魚類的免疫影響。

本實驗采用LC-MS技術對饑餓脅迫后的劍尾魚肝臟代謝物進行研究，對提取的差異代謝物經過KEGG網站分析代謝通路得出，饑餓脅迫主要對劍尾魚肝臟的糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝與FoxO信號通路造成影響，在這些代謝通路中，共篩選出8種具有顯著差異的重要代謝物：D-甘露糖、α-D-半乳糖、蔗糖、亞油酸、L-精氨酸、D-葡萄糖、牛磺酸和脫氧肌苷。這些差異代謝物的生理功能顯示，饑餓脅迫會對魚類的免疫、抗炎癥以及受傷后機體的修復能力產生影響。