精子鞭毛蛋白以及精子表面蛋白17的研究進展

唐 益，周 林，周宇鑫，劉 麗，趙璟璐，宮曉慶，遲長鳳

(浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養殖工程技術研究中心，海洋生物種質發掘與利用國家地方聯合實驗室，浙江舟山 316022)

精子相關蛋白是一大類與精子發生和形成、精卵識別以及頂體反應等受精活動密切相關的蛋白。MARTINES-HEREDIA，et al[1]利用雙向凝膠電泳結合離子質譜對人精子細胞進行了蛋白質組學分析，并根據這些蛋白在生理過程中所起的具體作用將其分為多種類型，包括與能量產生有關的蛋白，與mRNA 轉錄相關的蛋白，與蛋白質在體內的合成、轉運以及結構折疊有關的蛋白，與信號轉導有關的蛋白，與細胞骨架的形成有關的蛋白，與鞭毛的形成以及細胞運動有關的蛋白，甚至還包括很多未知功能的蛋白。隨著科技的進步，隨著各種分離純化、克隆、定位研究方法與技術的發展，使我們能夠在更深層面對于這一類生物因子的生理功能以及作用機理有更加深入的認識。

1 精子表面蛋白17

精子表面蛋白17(Sp17)最早是在兔精子中被發現的[2]，被認為參與了精子的頂體反應，是受精過程中的關鍵分子。而精子鞭毛蛋白最初定位于精子鞭毛鞘中，相關研究認為它可能參與了精子尾部鞭毛結構的形成以及功能。截至目前，眾多學者針對它們進行了結構、表達、定位以及功能方面的研究，并取得了豐富的成果。

1.1 理化性質

1994 年RICHARDSON，et al[2]首次在兔精子中發現了Sp17的存在，通過G22C 抗體實驗證明，Sp17 最早出現在頂體反應開始之后，并利用重組蛋白rSp17 在體外受精的實驗證明Sp17 能夠結合卵膜透明帶以及葡聚糖和硫酸葡聚糖。LEA，et al[3]克隆了人Sp17 基因的cDNA 全長，通過對編碼的氨基酸序列分析，發現它不含信號肽，沒有跨膜結構。WEN Ying，et al[4]利用免疫共沉淀的方法研究發現，在精子細胞完成獲能過程直至發生頂體反應之前，從兔精巢中分離得到的Sp17 在泳道中呈現出由22～24 kDa 大小不同的三種蛋白構成的蛋白三聯體，這樣的結果與RICHARDSON，et al[2]以及LEA，et al[3]通過SDS-PAGE 電泳得到的結果類似。然而，一旦對完成了獲能的精子細胞施以鈣離子刺激，其Sp17 氨基酸序列的C 端就會剪切掉部分序列，主要包括鈣調蛋白結合位點即IQ 結構域序列，從而產生大小為17～19 kDa的三聯體蛋白，并且隨著這種刺激作用的持續，分子量較大的三聯體蛋白數量逐漸減少，而同時分子量較小的三聯體蛋白數量逐漸增加。

LEA，et al[5]發現，Sp17 作為一種抗原在輸精管切除術后男性體內迅速增多，并證明了Sp17 蛋白表面存在2 個免疫顯性線性B 細胞抗原表位，這一點與重組蛋白HSp17 在體內的表達是不同的。ADOYO，et al[6]克隆得到了狒狒SP17cDNA 全長序列，并在體內發現了多種長度為0.8～1.35 kD的cDNA 序列，它們在3’非編碼區(UTR)存在差異，均編碼長度為163 個氨基酸的蛋白質，跟人的相似度達到97%，僅在靠近C 端的12 個氨基酸上存在不同。針對不同物種的Sp17 結構域分析發現，該蛋白中靠近N 端位置含有高度保守的DD CABYR SP17 結構域以及分布于靠近C 端位置的一個或多個IQ 結構域[7]，因此，Sp17 屬于鈣調素結合蛋白家族[8]。此外，其N 端的部分氨基酸序列在很大程度上跟CAMP 蛋白激酶A 調節亞基(PKA RII)高度相似[9]，氨基酸二級結構分析發現位于IQ 結構域內的氨基酸含有豐富的螺旋結構，這也預示著鈣調素與鈣調蛋白結合域中的α-螺旋結構的穩定可能具有某種天然的聯系[10-11]。而且不同物種Sp17 氨基酸鏈上均存在PEST 序列，進一步分析發現在其他含有鈣調蛋白結合域的蛋白質中也存在這樣的結構[12]。

1.2 組織表達特異性及生物學功能

O'RAND，et al[13-14]通過重組蛋白的實驗證明，Sp17 可以與雌兔卵膜透明帶上的糖蛋白R45 或者R55結合，因此，推測Sp17 可能作為結合透明帶表面糖基的分子而參與到頂體反應中，并促進受精作用。ADOYO，et al[6]通過Northern blot的方法確定了Sp17 在精巢中特異性表達，并利用細胞免疫的方法證明Sp17 主要分布于精母細胞、精子以及生精上皮組織中。然而CHIRIVA-INTERNATI，et al[15]通過人體免疫學研究發現Sp17 不僅在雄性生殖系統中表達，在其它正常的組織中也會有微量表達，尤其在呼吸系統特別是纖毛細胞中有較高的表達量[16]。

CAMP 結構中的PKA RII 是形成蛋白二聚化以及與蛋白激酶A 錨定蛋白(AKAPs)相互作用所必需的[17]。SP17 中N 端與之高度相似的氨基酸序列可能具有類似的作用。PEST 序列是一段含有豐富的脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸組成的短序列，長度大約為10 個氨基酸殘基，被證明與泛素化降解有關[18]，而SP17氨基酸鏈上的PEST 序列可能與頂體反應中高分子量的Sp17 蛋白被剪切掉C 端的部分序列以及鈣調素結合位點而最終呈現出小分子量的蛋白增加現象有關。

近年來針對Sp17的研究發現，相比于在普通正常組織中表達量極低甚至不表達，該基因在一些多發性骨髓瘤[19]以及卵巢癌細胞[20]中也具有大量表達，這一新的發現也打破了以往人們認為的Sp17 只能在雄性個體中精子不同形成階段發揮作用的認識。Sp17 基因的這一特點使其具有作為理想靶點的先決條件，為現代醫學中的靶向治療提供了明確的方向[21]。Sp17 在人體中的組織表達特異性分析表明，通常情況下Sp17 在女性體內正常組織中表達量極低，而在病變的卵巢癌組織中表達量很高，因此，曹王麗等[22]制備了高特異性抗Sp17的單克隆抗體3C12，成功用于卵巢癌抗腫瘤藥物的研究。而李芳秋等[23]通過RT-PCR 技術對大量腫瘤樣本的檢測發現，SP17的mRNA 在原發性卵巢癌組織中的檢出率高達84.5%，而不同來源的腫瘤組織中Sp17的表達量差異可能作為判斷卵巢癌組織來源的重要標志[24]。張春華等[25]在針對不孕癥的研究中發現這類男性的血清中存在抗Sp17 抗體，并認為它可以作為一種輔助診斷的指標用于醫學檢測，同時也說明Sp17的自身抗原性使其可能作為避孕疫苗的候選抗原而在避孕過程中發揮作用。張巧玉等[26]在實驗中利用重組Sp17 蛋白在小鼠體內獲得了高效特異性的表達，并獲得了具有一定生物活性的表達產物，這一研究成果為人類避孕藥的開發提供了一定的理論基礎。

2 精子鞭毛蛋白

2.1 理化性質

精子鞭毛蛋白1 和精子鞭毛蛋白2 同屬于精子鞭毛蛋白家族，被認為與精子鞭毛結構的形成有關。Spef1最初是在老鼠的2 號染色體上某個含有Cenpb[27]以及Cdc25C[28]基因的區域內被發現的。CHAN，et al[29]利用Northern 印記雜交顯示在小鼠體內存在不同長度的Spef1mRNA，克隆得到的兩種Spef1 cDNA 序列，均能編碼長度為234 個氨基酸，相對分子量約為27kDa的蛋白。通過進一步研究發現，Spef1的cDNA 在其3’UTR 區存在不同的轉錄起始位點，由此說明在較長的cDNA 分子中可能存在著可變的多腺苷酸化位點。此外，其氨基酸序列中還存在多個潛在的磷酸化以及糖基化位點，并在107-110 號氨基酸處存在潛在的核定位信號位點。

基于大量的精子鞭毛蛋白同源蛋白分析發現，根據其序列的保守性差異可以將這類蛋白區分為兩種類型，即Spef1 和Spef2，它們之間唯一的區別就是，Spef2 氨基酸序列中位于羧基末端的40 個氨基酸殘基在進化中極不保守，而且Spef2 主要在脊索動物中有表達。這樣的區別也暗示著它們在生物體內可能發揮不同的作用。雖然科學家根據對豬[30]不同組織中Spef2 基因表達研究結果預測人體內也可能存在兩種Spef2轉錄模式，但是目前通過實驗只檢測到1 種Spef2 轉錄本[31]。

CH 結構域最早是在鈣調蛋白中被發現的，它位于鈣調蛋白的N 端，長度大約為100 個氨基酸殘基，通常情況下除了肌動蛋白，還有細胞骨架蛋白以及信號蛋白這3 個主要的蛋白類別中也存在著不同數量的CH 結構域[32]。在三維結構上，具有球狀褶皺結構的CH 結構域由4 個主要的螺旋結構組成，其中3 個形成了1 個寬松的三重螺旋束結構，彼此之間由loop 結構串聯[33]。針對氨基酸序列的分析發現，Spef1 與Spef2的N 端均存在1 個2 型CH 同源結構域(CH2)，這意味著它可能具有結合F 肌動蛋白的能力。而在靠近C 端的位置存在1 個具有鈣結合能力的EF-hand 結構，預測可能參與調節Spef2 生物活性。此外，在靠近N 端位置還存在1 個DUF1042 結構域，該結構域的功能目前未知，但是研究發現在與精子鞭毛相關的蛋白[34]中均存在這樣的結構域，例如Spata4 蛋白(NP_653245)以及來自單細胞生物萊茵衣藻的Cpc1(AAT40991)。值得注意的是，在Cpc1 蛋白[35]中同樣存在EF-hand 結構，科學家通過突變Cpc1 基因的研究發現，它與中央微管的組裝有關并能影響鞭毛擺動頻率。

2.2 組織表達特異性及生物學功能

Cdc25C[28]是一種細胞周期調節蛋白，該蛋白主要在精巢中表達并參與精巢的某些功能；Cenpb[27]也被認為跟精巢的某些生理功能有關。而Spef1 作為Cenpb 臨近的下游基因，很可能也在精巢的某些功能中扮演著重要角色。研究人員通過Western blot 以及RT-PCR 對小鼠不同發育階段各組織中Spef1 基因mRNA含量的分析發現，Spef1 基因主要在精巢組織中有大量的表達[29]。并利用Spef1 抗體通過免疫熒光的方法對Spef1 在小鼠體內的表達進行定位，結果顯示Spef1 在小鼠精巢的生精上皮組織中有大量表達，進一步的實驗發現Spef1 在不同時期的曲精小管腔內也會產生離散信號，但是，最早檢測到Spef1 信號是在小鼠精子產生的第九個階段[36]，且隨著精子逐漸發育成熟，蛋白信號不斷增強，推測老鼠Spef1 可能參與了精子的發生、形成以及鞭毛結構的形成過程。雖然利用免疫技術在精子鞭毛結構的外層致密纖維以及纖維鞘中均發現了Spef1 蛋白的存在，但是它與這些結構之間存在的聯系目前尚不清楚。Spef1 蛋白在自然界中分布比較廣泛，截至目前，Spef1的一些同源基因已經在脊索動物海鞘Pyrosomella verticilliata[37]以及單細胞原生動物衣藻Chlamydomonas[38]的體內被相繼發現。在某些原生動物例如鞭毛蟲或者纖毛蟲[39-41]中也發現了Spef1 同源蛋白的蹤跡，而且在氨基酸序列上高度保守，這些證據表明，Spef1 極有可能參與了鞭毛結構的形成或組裝，這種作用可能與它在精子鞭毛的形成過程中所起的作用是相似的。此外，在哺乳動物老鼠、人體內也發現了它的同源蛋白。對Spef1 基因的組織表達特異性分析發現除了精巢，在其它組織中也檢測到了微量的Spef1 基因表達，這可能是由于Spef1 在某些具有鞭毛或者纖毛結構的組織中也起著類似作用的緣故[42]。

SIRONEN，et al[34]的原位雜交結果顯示Spef2的mRNA 主要在晚期精母細胞以及圓形精子形成階段表達，而RT-PCR 結果表明，Spef2 基因主要在精子發生的1-7 階段大量表達，并從第九階段開始表達信號逐漸減弱，之后利用酵母雙雜交系統以及免疫共沉淀的方法驗證了Spef2 與蛋白ITF20[43]之間的相互作用關系。基因突變實驗結果表明，Spef2 基因突變會導致家豬出現短尾精子從而造成精子運動活力的大幅度減弱[30]，進而影響受精過程。而這些異常的精子會呈現出鞭毛結構中央微管結構、外圍纖維鞘結構、外部致密纖維結構以及線粒體鞘結構的異常，最嚴重的會導致精子鞭毛主體結構的部分缺失[44]，這些結構上的缺陷極大的影響了精子的活力以及受精的成功率。然而，除了在精子細胞，Spef2 也被認為可能在那些含有鞭毛、纖毛以及軸絲結構的組織中有大量的表達，這可能是因為鞭毛和軸絲結構在生物體內有著相同的發育起點。

3 展望

截止目前，除了Sp17 以及Spef1、Spef2 以外還有多種基因被認為參與了精子形成或者受精過程，包括H1fnt、Gopc、Agfg1、Gba2、Crem、MNS1、Spag16、Kif3a 和KLC3 等。然而針對相關基因和蛋白的研究主要局限于哺乳動物，伴隨著科學技術的發展與進步，它們在生物體內的功能以及作用機理將被進一步揭示，與此相關的研究也將繼續進行，將極大的豐富對于動物生殖發育的研究內容，并可能為醫學診斷以及藥品開發提供良好的思路和借鑒。