急性呼吸窘迫綜合征新生兒血清miRNA-143和CD4+ T細胞亞群表達的相關性

嚴麗麗，周錦龍，張子宇，鄒 芳，唐文燕

(江西省婦幼保健院a.新生兒科NICU； b.病理科分子實驗室，南昌 330006)

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)作為一種常見的呼吸道疾病，其患者人群無明顯的年齡界限，可見于各年齡段[1]。臨床上ARDS的死亡病例通常由繼發性肺纖維化與多器官功能障礙直接導致[2]。研究者[3]在ARDS動物模型的肺組織內觀察到了廣泛浸潤的單核巨噬細胞和T淋巴細胞，以及異常的氧化應激和相關炎癥反應，伴隨著成纖維細胞的病理性增殖，細胞外基質的多次受損、修復及過度沉積。

施凱等[4]采用microRNA微陣列芯片篩選了ARDS患者差異性表達microRNAs，并通過實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)進行驗證，結果發現miR-143的表達水平與纖維化疾病有顯著關聯。過表達miR-143會通過靶向沉默ADAMTS-1進一步促進肺成纖維細胞的增殖分化和膠原蛋白的合成，提示miR-143可能是一種促肺纖維化因子。miR143在早期ARDS患者體內即升高，且濃度穩定，可作為關鍵的指示標志物。免疫功能紊亂也是ARDS發生和發展的重要因素，其中CD4+T細胞亞群的數目和表達譜變化在殺傷病原體、影響肺組織缺氧性損傷和結構重塑、調控機體炎癥反應等方面發揮重要作用。基于此，本研究旨在探討ARDS新生兒血清miR-143和CD4+T細胞表達的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年12月至2020年10月江西省婦幼保健院治療的ARDS新生兒共80例，按照病情嚴重程度分為輕度、中度及重度3組，3組一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。納入標準：1)經胸部CT、動脈血氣等檢查，符合ARDS診斷標準[5]；2)發病時間小于72 h；3)臨床資料完善。排除標準：1)先天肺發育不良或合并其他肺部疾病者；2)不能配合臨床治療者；3)短時間內進展至多器官功能障礙者。

表1 3組一般臨床資料比較

本研究經醫院倫理學委員會批準，患者家屬知情同意。

1.2 治療方法

患兒入院后即完善相關檢查，開放靜脈通路。連接呼吸機，采用同步間歇指令通氣(SIMV)模式，其他設備具體參數：吸入氧濃度(FiO2)30%～40%，流量為2～8 L·min-1，呼氣末正壓(PEEP)為5～7 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，動脈血氧分壓(PaO2)60～80 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，動脈二氧化碳分壓(PaCO2)40～50 mmHg，經皮氧飽和度(SpO2)88%～92%。

1.3 觀察指標和檢測方法

患兒入院后24～48 h內，在藥物和輔助機械通氣治療前采集外周靜脈血進行檢測。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血清miR-143和轉化生長因子-β(TGF-β)的表達水平；采用流式細胞術檢測CD4+T細胞百分比，使用美國BD公司流式細胞檢測儀及配套試劑，按照說明書步驟進行。

qRT-PCR主要流程：采集外周靜脈血5 mL于抗凝管中，3000 r·min-1離心20 min后，使用移液槍吸取上層血清，置于-80 ℃保存。使用Trizol RNA提取試劑提取血清總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA模板。按照qPCR試劑盒說明書，將相應試劑與模板混合于八聯管，置于qPCR儀中，設置各循環進程溫度及時間參數后進行擴增。miR-143上游引物序列5’-ACATTGCAGCTGCCAAAAT-TT-3’，下游序列5’-ACAGGCCAGCTTTGTA-3’；TGF-β上游引物序列5’-AGGCCGGTTAAGACTTG-3’，下游序列5’-CATAAGCCAGCGC-GAT-3’；內參U6 上游引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCA-3’，下游序列5’-AACGCTTCACGAA-TTTG-3’。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 3組血清miR-143、TGF-β水平及CD4+T細胞百分比比較

重度組血清miR-143及TGF-β水平顯著高于中度組與輕度組，中度組水平高于輕度組(均P<0.05)；重度組血清CD4+T細胞百分比低于中度組與輕度組，中度組占比低于輕度組(均P<0.05)。見表2。

表2 3組血清miR-143、TGF-β表達水平和CD4+T細胞百分比比較

2.2 ARDS患兒血清miR-143水平與TGF-β、CD4+T細胞百分比的相關性

ARDS患兒血清miR-143與TGF-β水平呈正相關，與CD4+T細胞百分比呈負相關(r=0.984和-0.979，P<0.001)。見圖1。

TGF-β/(μg·L-1) CD4+T/%

3 討論

一般情況下，ARDS整個病程中均伴隨肺組織的纖維化，繼發性肺纖維化是導致ARDS患者死亡的一個主要原因[6]。多種microRNAs(如miR-21、miR-320、miR-143等)與ARDS的發生與發展密切相關，并與臨床轉歸有一定關聯。

本研究結果表明，重度組血清miR-143和TGF-β水平比中度組及輕度組更高，且輕度組最低，提示血清miR-143和TGF-β表達水平升高可能與ARDS病情的加重有密切聯系。miR-143與纖維化相關疾病具有一定相關性，其表達在纖維化的小鼠肺組織中有所上調。miR-143的靶基因中存在一種Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS-1)，過表達miR-143通過靶向沉默ADAMTS-1進一步加快肺成纖維細胞的增殖分化與膠原蛋白的合成，說明miR-143可能是一種促肺纖維化因子。TGF-β能夠對細胞生長與分化發揮重要的調節功能，在急、慢性肺損傷的發生過程中扮演重要角色[7]。ARDS患者肺灌洗液中能夠檢測出高水平的TGF-β與白介素-8，TGF-β能夠促進肺炎的發生與肺纖維化，誘導肺組織細胞表達高水平的結締組織生長因子，進一步加快肺纖維化的發展進程[8]。重癥ARDS成人患者血清 TGF-β與骨形態發生蛋白-7等細胞因子水平提高幅度增加，患者病情愈嚴重、臨床預后愈不樂觀，其提高幅度則愈大。

miR-143過表達并靶向結合轉錄基因，進而導致TGF-β和炎癥因子表達異常，影響ARDS疾病進程。機體內廣泛分布多種microRNAs，參與多條細胞信號通路和細胞生理過程，如細胞增殖、分化、凋亡、血管生成以及炎癥和免疫反應等[9]。例如，miR-29通過抑制SIRT1基因，促使肺泡上皮細胞凋亡增加，細胞表面鈉通道活性改變，影響肺功能；而過表達miR-125b能夠逆轉肺通透性，減少肺泡灌洗液中多種炎性因子和趨化因子水平，減弱炎癥細胞浸潤，改善疾病模型小鼠存活情況[10]。

本研究還發現，重度組外周血中CD4+T細胞百分比顯著低于中度組和輕度組，且輕度組最高。血清miR-143與TGF-β水平呈正相關，與CD4+T細胞百分比呈負相關。這可能是由于ARDS的發生與機體CD4+T細胞介導的細胞免疫功能下降有關，與此同時，血清miR-143與TGF-β水平的升高還會影響細胞免疫功能。

綜上所述，miR-143的異常高表達可能與新生兒ARDS的發生發展有關，可能通過促進TGF-β表達和影響CD4+T細胞免疫功能來發揮病理作用。