中藥材鑒定運用分子標記技術的實踐探尋

謝 薇

中藥為我國中醫(yī)學必需的治療方法，在保健、養(yǎng)生、治療疾病等方面起到不可替代的作用。分子鑒定技術逐漸成為中藥鑒定的主要鑒定方法，是通過直接分析遺傳物質的多態(tài)性以推斷物種內遺傳變異情況，以實現(xiàn)藥材鑒定的方法[1]。本文對分子標記技術分析和總結了該方法的優(yōu)缺點，并闡述了分子鑒定技術未來發(fā)展方向。

1 分子標記技術的分類

分子鑒定技術分為：以mDNA為基礎的分子標記技術、基于傳統(tǒng)Southern印跡雜交技術的分子標記、以PCR為基礎的分子標記技術、以重復序列為基礎的分子標記技術、DNA序列分析、DNA條形碼技術[2]。

1.1 以RP-PCR為基礎的標記技術以RP-PCR為基礎具有操作簡便、敏感性高、特異性強、高通量等優(yōu)點，其主要引用在遺傳多樣性分析和對中藥材快速鑒定中，存在的缺點為無法避免基因組DNA、定量準確性弱、并且鑒定的誤差較大[3]。

1.2 Southern雜交技術的標記技術主要為RFLP、單鏈多態(tài)性RFLP、變性梯度凝膠電泳-RFLP技術等，具有標記數(shù)目無限、大部分標記具有明顯性、任何生育期可進行預測、不受到外部環(huán)境的影響且存在高度的變異性，多用于中藥的多樣性分析和品種鑒定分析，存在缺點為準確性較差、容易產生假現(xiàn)象[4]。

1.3 以重復序列為基礎的標記技術主要有DNA重復序列應用于ISSR技術，為DNA微基礎的分子標記，其原理為用錨定的DNA為引物，在PCR反應中可是錨定引物引起特定位點退火錨定引物互補和不太重復序列的DNA片段，開展PCR擴增，可擴增為多個條通過聚丙烯酞胺凝膠電泳進行分辨，以發(fā)生顯性反應[5]。

1.4 以mDNA為基礎的標記技術主要為逆轉錄PCR、差異顯示、差異顯示逆轉錄PCR、特征性差異明顯，其中RT-PCR技術比較廣泛，是PCR廣泛應用的變形形式[6]。一條RNA鏈被逆轉錄為相互補充的DNA，并通過PCR模板進行DNA擴增。

1.5 DNA條形碼技術的標記技術主要優(yōu)點為不受形態(tài)特征和生物個體發(fā)育的限制、檢測樣本的范圍較廣，檢測具有高效、準確、實現(xiàn)自動化和標準化的優(yōu)勢。主要應用于品種鑒定、指紋圖譜構建、遺傳育種及多樣性分析方面的鑒別[7]。該種鑒別方法的缺點為不能對藥材具有的DNA差異進行烙印。

2 分子標記技術的應用

分子鑒定技術在中藥鑒定中主要表現(xiàn)為多基原鑒定、遺傳多樣性、正品替代品鑒定、真?zhèn)舞b定、產地鑒定及年限鑒別等。

2.1 多基原鑒定應用分子鑒定技術鑒定中藥基原的研究，貝母、黃芩、太子參、枇杷通過ISSR技術進行遺傳多樣性鑒定，溪黃草可通過RAPD技術進行鑒定[8]。相關研究通過比較商品沉香、白木香、人工誘導沉香為材料，將醇溶性浸出物、顯微、形狀等進行鑒別，通過基因測序進行序列側列，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構建最大簡約樹和鄰接樹。商品沉香、人工沉香醇溶性浸出物提高10%，另可通過《中華人民共和國藥典》中顯微鑒別的規(guī)定進行[9]。沉香種內遺傳存在距離，中間也存在距離。人工沉香、白木香、商品沉香均為發(fā)育樹上的一支，在鑒別理化性質和浸出物基礎上，再通過ITS2條形碼序列可準確鑒定基原物，為沉香鑒定分子生物學的研究提供依據(jù)。

2.2 遺傳多樣性鑒定有研究通過ISSR分子標記技術鑒別48份不同生態(tài)環(huán)境的絞股藍材料，探索其親緣關系和遺傳多樣性，結果顯示在15條擴增條帶中，存在多態(tài)性明顯引物和穩(wěn)定性，共增加DNA擴增位點200余個。說明絞股藍遺傳多樣性較高，種質間的親緣關系、生態(tài)環(huán)境、地理分布完全不一樣。

2.3 正品和替代品鑒定中藥材正品為《中華人民共和國藥典》收載的，替代品為與正品有親緣關系且藥效相似的但未收錄到《中華人民共和國藥典》中。分子鑒定技術可將正品和替代品進行鑒別和區(qū)分，研究采用ISSR、SRAP、SC0T分子標記等分子鑒定技術對冬蟲夏草和替代品進行鑒定，對所有菌株進行有效區(qū)分且為總體狀況相同，可作為冬蟲夏草種內、株內鑒定的方法[10]。也有研究顯示通過對獨活樣本的ITS序列測序和擴張，將樣本分為4大類，ITS序列具有堿基片段，可通過ITS序列鑒定物種，能夠為獨活的分類和鑒定提供有利證據(jù)。另外，通過ITS序列鑒別四帶芹類可作為獨活的首選替代品，牛尾獨活次之，九眼獨活可作為藥用上品。

2.4 真?zhèn)舞b定中藥材的真?zhèn)舞b別多采用纖維鑒定方法，對鑒定人的專業(yè)水平有較高的要求，科學依據(jù)標準不統(tǒng)一，如采用化學計量法鑒別不但費時還浪費時間[11]。近些年來相關研究發(fā)現(xiàn)，通過分子鑒定技術鑒定中藥材真?zhèn)蔚臏蚀_性較高，并且比較省時省力。常用于中藥材烏梢蛇、重樓、西洋參、三七、人參、紫蘇的真?zhèn)舞b別。有研究以新疆藁本、遼藁本及藁本混偽品白芷、當歸、石防風為鑒定材料，通過提取樣本的DNA進行序列擴增，進行雙向測序可進行多序列比對，構建系統(tǒng)的發(fā)育樹，能夠鑒別新疆藁本和遼藁本的混偽品。混偽品材料及當歸的序列測序，可對其基因序列進行分析比對，通過計算材料間的距離構建系統(tǒng)進化樹。且測定trnL-F序列順序，發(fā)現(xiàn)混偽品材料的堿基具有明顯差異，并且可特異鑒別A堿基重復區(qū)域。混偽品間存在距離，通過trnL-Fxu序列對發(fā)育樹進行重建并將混偽品和真品進行區(qū)分[12]。通過rpoC1序列比對無法找到混偽品和當歸的差異位點。另外，進化樹也無法找到差異，說明通過rpoC1序列鑒別效果不佳，而可通過trnL-Fxu序列以堅定混偽品的分子鑒定方法。研究當歸的混偽品通過基因組多態(tài)性分析，從重復系列引物進行篩選出多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的引物并對其進行擴增，已獲得更多基因組引物。可將UBC848引物組正品和混偽品分開鑒別，根據(jù)重復序列技術分析找到混偽品和當歸的特異鑒別引物。通過SNP分子標記重新建立的PCR體系能夠實現(xiàn)人參品種大馬牙的鑒別分析，具有特異性條帶，確實因大馬牙特異性擴增得到擴張。建立多重PCR系統(tǒng)可實現(xiàn)大馬牙的鑒定，作為大馬牙品種鑒定的有效技術手段。

2.5 產地鑒別中藥產地繁多，其中以道地藥材為質量最佳，對于中藥材的產地鑒別特別重要。近些年隨著中藥現(xiàn)代鑒別技術對中藥產地進行鑒別研究。研究顯示通過ISSE技術對丹參不同產地的樣本進行鑒別[13]，也有通過DNA分析標記技術聯(lián)合高效液相色譜對金銀花不同產地樣本進行鑒別，利用分子ISSR-PCR分子標記對菘藍不同產地進行鑒別。有研究顯示利用ISSR分子標記技術對甘肅省不同產地的當歸樣本進行分析，通過軟件分析基因多樣性指數(shù)和遺傳信息，群間基因分數(shù)距離變化范圍較大[14]。說明栽培當歸在甘肅地區(qū)遺傳多樣性較高，群間的遺傳多樣性明顯高于群內，居群間遺傳分化程度較高，但無基本基因交流情況。

2.6 年限鑒別研究顯示通過提取人參細胞中的端粒長度和端粒酶活性能夠通過DNA鑒別人參生長年限，通過染色體片段分析人參端粒平均長度，端粒長度可隨著年限的延長而延長，在此基礎上可通過端粒長度數(shù)據(jù)鑒別人參的生長年限。對不同生長年限、不同產地、不同品種的人參樣品經過提取RNA采用PCR擴增，擴增產物的序列，從多份人參樣本中獲得符合測序要求的PCR產物，并與人參DS基因比對，建立PCR測序發(fā)掘人參基因的SNP序列，具有操作簡單、特異性[15]。分子標記技術可作為人參和相關藥材產品質量評價遺傳的工具。另有研究對水杉不同部位和不同年限的DNA進行提取，并進行序列擴增實驗，結果顯示經改良后的水杉DNA片段提取法，能夠保存DNA片段擴增，在選擇DNA提取樣本中，邊材比心材更適合，水杉木材DNA具有篩選分析、遺傳距離、序列特征分析，以進行系列物種鑒別。

3 存在問題

中藥分子鑒定技術被廣泛應用在各個領域，但隨著分子鑒定技術的發(fā)展也遇到了需要解決的問題。通過分子遺傳標記技術對道地藥材鑒定存在局限性，表現(xiàn)在自身技術缺陷，基因的真實性和DNA的同源性，分子標記結果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性；另外研究對象也存在一定問題，不是所有的道地藥材會有DNA印跡，道地性和DNA差異不存在直接關聯(lián)。隨著分子生物學研究的不斷深入，技術缺陷問題已經得到解決，第2個問題仍然困擾著中藥分子鑒定領域的專家學者。

4 小結

中藥材的品種繁多，來源較復雜，且產地較多，相近的中藥極易造成混淆，甚至出現(xiàn)中藥用藥部位不同但療效相似的偽品和仿品充當真品。鑒定方法不完善會導致用藥不安全事件發(fā)生，對中藥臨床療效帶來影響。《中華人民共和國藥典》已經收錄了部分中藥材的分子生物學鑒定方法，說明分子鑒定的時代已經到來。雖然分子鑒定技術還需要進一步發(fā)展，但隨著廣大研究者的不懈努力和技術進步，分子鑒定技術一定能夠成為中藥鑒定的主要方法，為中醫(yī)藥走向國際提供技術保障。