植物葉片掃描電鏡樣品不同處理與觀察方法的研究進展

劉 樂 王文可

（河南師范大學生命科學學院 河南新鄉 453007）

掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM） 自1973年[1]開始用于觀察植物葉表皮的微觀形態。大多數SEM 成像是利用高真空下的二次電子探測器處理，得到植物的器官，特別是表面結構如毛狀體、氣孔、保衛細胞等的偽三維圖像[2]。比起運用光學顯微鏡進行植物樣品的觀察，SEM 可以觀察到更加細微的結構特征，更清晰地展示出植物表面的微形態特征，從而對未知植物進行鑒定[3-4]?，F階段對植物葉片樣品的處理方式有多種，文章主要對葉片處理過程中固定、脫水置換、干燥及樣品觀察的不同研究方法進行了歸納比較，并對相關研究進展進行討論，為研究者有效地進行SEM 葉片制樣及觀察提供一些有用信息。

1 SEM 葉片樣品制樣要求

樣品的預處理對后期觀察效果有一定影響，若是處理葉片的方法不當，葉片很大可能會產生皺縮，影響葉片形態結構的觀察與分析。在進行SEM 植物葉片樣品的制備時，應滿足以下要求：（1）樣品的導電性好，不會產生荷電效應[5]；（2）樣品要盡可能處于干燥狀態，若樣品中有水分，水分揮發會造成圖像模糊、損壞電鏡部件等；（3）樣品的熱穩定性好，避免分解釋放的氣體或其他物質污染儀器；（4）樣品不能具有磁性[6]。

2 SEM 葉片樣品的處理

2.1 不同固定方式對樣品成像的影響

大部分植物葉片在脫水前需要進行固定處理。經過固定的樣品，在脫水及導電處理等后期制樣時，樣品的結構不易改變，更易保持原有葉片的形態[7]。固定時需要根據植物葉片的特點和觀察要求，選擇合適的固定液。對于不同的樣品材料，其固定處理有多種不同的方式。目前，在對植物葉片固定處理中，選用較多的方法是運用戊二醛、FAA、鋨酸、卡諾固定液、甲醇等固定。

在固定液的選取上，戊二醛固定液與戊二醛—鋨酸雙固定液相比，雙固定液的效果更優，但效果差異不明顯[8]。對一些較容易固定液或不容易變形的材料，從降低實驗成本考慮，可使用戊二醛進行單固定。在戊二醛單固定處理生物樣品時，利用超聲和微波處理，可以改善用戊二醛單固定效果的缺陷[9]。除此之外，固定液的選擇也會影響最終葉片樣品的形態飽滿度，運用戊二醛或FAA 固定會導致樣品的大面積收縮[10]。經過甲醇固定處理的樣品，效果要優于傳統的戊二醛作為固定液[11]。與其他溶劑型和水性固定方法相比，甲醇固定和脫水以及隨后的乙醇脫水能夠更好地維持樣品表面形貌和組織尺寸[12]。甲醇固定逐漸被大多數研究者選用，其中以甲醇浸泡10 min 并在臨界點干燥保存各種植物的組織形態為宜[13]。

固定液濃度的選取很大程度取決于葉片樣品的含水量和幼嫩程度。例如在對月季花瓣固定液濃度的探索中[14]，研究者分別對濃度為2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%的戊二醛溶液的固定效果進行了比較。過低或過高濃度的戊二醛溶液處理柔嫩、含水量高的葉片時（4 ℃中固定4 h），絕大多數葉片表面失水嚴重，導致表面形態觀察不清晰。選擇適合的濃度進行固定處理，觀察效果相對較好，葉片細胞形態相對飽滿。在月季花瓣固定處理中，最佳固定液濃度為7.5%。

2.2 脫水置換條件的探索

大部分植物葉片需先進行脫水干燥的處理并鍍金，之后才能進行掃描電鏡的觀察[15]。對于植物葉片樣品的脫水置換處理，常用方法是運用梯度乙醇溶液進行脫水，各濃度脫水15 min，之后用叔丁醇置換100%乙醇。在室溫下先使用乙醇-叔丁醇溶液置換20 min，再用100%叔丁醇置換30 min，之后用100%叔丁醇重復置換1 次[4]。除此之外，置換過程中省去乙醇-叔丁醇溶液的處理，直接用100%叔丁醇置換3 次也能得到較為理想的結果[16]。

除此之外，研究者在脫水處理前可以采用配制所選固定液對應的緩沖液進行反復清洗，以除去固定液，防止戊二醛和鋨酸反應或避免戊二醛和脫水劑（乙醇、叔丁醇）反應，導致產生沉淀而影響固定效果[17]。

3 不同樣品干燥方式的比較

在制樣過程中，少數植物葉片樣品無須干燥處理，可以直接用SEM 進行觀察，如黑麥葉片[18]、龍須草[19]、梯牧草等。而大多數植物組織中含有大量水分，在SEM 下，水分的揮發會造成圖像漂移，影響實驗后期觀察，同時對儀器有很大的損害。對樣品干燥處理的方法多樣，例如自然干燥法[20]、烘干干燥法[21]、臨界點干燥法、叔丁醇真空干燥法、硅膠干燥法[22]、叔丁醇一步冷凍干燥法和冷凍干燥法[23]等。

其中自然干燥法無設備條件的限制，簡單易行，操作方便，但干燥過程中存在的表面張力會導致樣品發生形變[4]，樣品表面發生收縮、龜裂或塌陷，僅適用于老葉或含水量較少、細胞壁和蠟質層較厚的植物葉片。烘干干燥法干燥速度較快，操作簡便，但葉片可能在干燥后發生形變甚至斷裂，嫩葉經處理后發生嚴重的收縮現象，適用于比較堅硬且耐熱的植物葉片，如被子植物葉片[24]。叔丁醇真空干燥可干燥大量樣品，相較于冷凍干燥法而言，對樣品損傷小，能較好地保持樣品原貌[13]，但叔丁醇的凝固點為25.5 ℃，在低溫室內即可凝固，不利于后續實驗的進行，操作較煩瑣，適用于各類型的植物葉片。硅膠干燥法操作迅速、方便，硅膠可回收，經濟、簡易，可循環利用，可用于野外干燥保存[25]，但含水量較多的植物組織會發生嚴重的收縮現象，葉片腹面褶皺嚴重，對樣品形態損壞嚴重，后續回收硅膠步驟比較費時[24]，適于含水量較少的植物組織。叔丁醇一步冷凍干燥法操作簡單、方便快捷，叔丁醇在冷凍時固相重結晶的機會少，可減少冰晶對樣品的損傷，適用于各類型的植物樣品。冷凍干燥法能反映樣品真實的微形態特征，但冷凍干燥過程中冷凍和脫水應力會造成植物葉片的損傷，操作需掌握最佳冷凍干燥溫度與時間[26]，適用于幼嫩、含水較多的葉片。臨界點干燥法能最大限度地還原樣品原貌[21]，但操作步驟煩瑣，費時費力，需專業儀器設備，且易在干燥過程中損傷植物樣品，適用于各類型的植物樣品，如苔蘚[27]。

4 SEM 圖像條件的探討

SEM 利用的是高能聚焦電子束，通過這一物質來掃描樣品表面[28]，收集二次信號[29]以得到可以清晰地顯示樣品形態、微觀結構的高質量圖像。在SEM 成像過程中，影響圖像質量的因素比較多，例如對樣品溫度的控制、圖像參數的選擇、檢測器的選擇等[30]。

4.1 成像參數的選擇

想要獲取效果最佳的SEM 圖像，需要對影響圖像質量的參數進行調節，例如加速電壓。研究者可以根據樣品的不同特征和觀察需要，選取合適的加速電壓。加速電壓與圖像的分辨率相關，在低加速電壓下，電子束穿透的深度淺，得到的圖像襯度好，可以較為清晰地表現樣品表面的微觀形貌[31]。適當提高加速電壓可以增大二次電子強度，提升圖像的清晰度。但如果加速電壓過高，電子束的穿透能力會隨之增強，擴散區加大，導致二次電子與散射電子發射，甚至會造成二次電子被散射的后果，出現疊加的虛影[31]，導致圖像的分辨率下降，無法清楚顯示樣品表面的微細結構，同時還會減少SEM 儀器燈絲的壽命[32]。

在以禾本科龍須草[19]的葉片為材料進行加速電壓的探討中，研究比較了掃描電鏡在不同加速電壓（5 kV、10 kV、20 kV）下的觀察效果。結果表明，對于龍須草而言，10 kV加速電壓條件下觀察效果更好。在觀察艾葉[20]、桑葉[32]的實驗中發現，加速電壓范圍為5～10 kV 時，SEM 圖像效果更好。在觀察十字花科雙子葉植物[32]，如油菜和白菜時（含水量大于80%），樣品制備后，在5～15 kV 的加速電壓下圖像成像質量較好。

4.2 觀察儀器的選擇

大部分植物葉片樣品中含有大量水分，若不經過前期處理，葉片表面放電嚴重難以進行觀察分析，而且會對儀器造成損傷。而植物樣品經過干燥、脫水處理后，很多信息會發生變化。特別是對于觀察氣孔而言，常規的SEM 制樣處理后，葉片的氣孔大部分呈現關閉狀態，無法觀察其特征[33]。隨著科學技術的不斷發展，SEM 在各方面有了較大的改進，功能越來越齊全[28]。除了常規SEM，還有環境掃描電子顯微鏡、場發射掃描電子顯微鏡、冷凍掃描電鏡等。

冷臺法SEM 觀察需配有冷臺的SEM，它在樣品室內有專門控制溫度的設備。冷臺法的制樣過程簡單快速，不需要對樣品進行脫水和干燥等處理。只需將植物葉片樣品用冷凍膠水固定于樣品托上，隨后放至電鏡的樣品艙中的冷臺，即可在低溫下迅速得到較為清晰的植物表皮圖像，從而獲取未經過噴金、脫水等處理的葉片表皮信息。前期研究結果表明，冷臺設置在較低的冷凍溫度有利于樣品的穩定性[34]。

使用環境掃描電子顯微鏡觀察時，將樣品裁剪成合適大小后便可直接進行觀察，簡便快捷。但在環境掃描電子顯微鏡下，部分樣品會出現失水嚴重的現象，圖片襯度不理想[28]。

冷凍掃描電鏡的操作較簡單，最快的情況下5 min 便可觀察樣品。冷凍掃描電鏡儀器具有儀器內溫度低、樣品冰晶產生少、相對濕度高等特點，從而可以維持樣品原貌[13]。使用冷凍掃描電鏡觀察的植物樣品少有塌陷或是皺縮的現象，樣品形態大都飽滿，表面較為清晰。但由于其價格昂貴，目前還未被普遍使用。

場發射掃描電子顯微鏡是最近幾年研發出的一種表面觀測設備，它具有高效、簡便的優點，對所觀察樣品的微觀形態傷害極小[35]。同時，場發射掃描電子顯微鏡具有分辨率高、景深大、圖像更有立體感、放大倍數可調范圍寬等特點[31]。但其對環境要求較高，樣品制備具有一定難度。

5 結語

葉片是植物主要的營養器官之一，植物葉片的觀察在鑒定植物種類方面具有非常大的作用。植物的葉表皮特征具有一定的遺傳穩定性，葉表皮的微形態特征也能一定程度反映類群間的親緣關系[36]。目前，無論是利用何種方法進行SEM 樣品的前期處理，都無法完全避免細胞的皺縮、膨脹等形變。同樣，不同植物的葉片結構、組成等特征具有差異，沒有一種SEM 處理和觀察方法能夠適用于所有類型的植物葉片。高含水量的樣品經過脫水干燥處理后，要想獲得在電鏡下清晰、細胞形態飽滿且沒有皺縮塌陷的圖像，目前來說還只是一個理想的狀態。未來能否有一種既簡單方便又能達到更好效果的方法，還需要大家繼續探索。