淺談植物細菌診斷技術

曲彥達 劉文鈺

（沈陽工學院生命工程學院 遼寧撫順 113122）

植物病害防治在食品質量和生產中具有重要的作用，作物感染病原菌（如細菌、病毒和真菌）造成的糧食損失是農業生產中長期存在的問題[1]。病原體、動物和雜草造成的損害占全球農業生產力損失的20%～40%。了解和控制植物病害的基本前提是做好早期檢測和鑒定病原，防止疾病傳播和食物損失。

目前，投入作物生產的全部預算限制了病原菌檢測方法的常規使用，有學者提出采用先進的病害檢測方法，最大限度地減少和預防作物在生長、收獲和收獲后加工過程中的病害危害，并最大限度地提高生產力，確保農業可持續發展[2]。

在植物病蟲害中，重點研究了植物病原菌及相關診斷技術。這些類型的病原體對作物的生產力和產量造成毀滅性的影響。曼斯菲爾德及其同事[3]根據科學/經濟重要性，描述了細菌性植物病原體“TOP10”清單。這項調查允許建立一個按順序排列的名單：紫丁香假單胞菌致病菌；青枯菌；根癌農桿菌；稻葉枯單胞菌；野油菜黃單胞菌；黃單胞菌；果膠桿菌和萎縮果膠桿菌。這份名單是部分的，因為沒有考慮其他重要的病原體，如分枝桿菌和沙氏假單胞菌。

植物病原菌可以在不同的環境中生存：在植物中作為病原體，在宿主之外作為腐生植物和附生植物。不利的環境條件可能會降低細菌存活率，并危及疾病的發生和傳播[4]。相反，當病情好轉時，可能出現感染周期。降雨、受污染的農業設備和/或植物材料、昆蟲促進了植物細菌的傳播。由細菌引起的疾病癥狀包括葉斑病、枯萎病、枯萎病、結痂病、潰瘍病、腫瘤和根的軟腐病等。

1 細菌病原檢測與鑒定

植物癥狀觀察是疾病管理的第一步，采用光學方法觀察。一系列國際文件中描述，疾病的檢測和/或鑒定實際上是實施植物檢疫措施的關鍵步驟。國際植物檢疫措施標準（ISPM）第27 號描述了官方診斷受管制有害生物的程序和方法，并提供了可靠診斷的最低要求。

診斷方法可作為檢測植物基質中細菌的篩選試驗和/或鑒定純化細菌培養物特性的試驗。篩選試驗直接評估病原菌在植物基質中是否存在，可以利用不同的技術進行。當需要進行快速診斷時，這些分析尤其有用，因為大量種子/植物繁殖材料、等待檢疫診斷、商業貿易對象在機場或港口受阻。當篩選試驗結果為陰性時，可迅速移取材料，反之，陽性結果則需在純培養基上進行分離和鑒定試驗，以確認結果[5]。

目前，基于顯微鏡、血清學、生物化學、生理學、營養學、分子工具和培養繁殖等不同原理的一些技術被用作診斷工具。

血清學提供了細菌性疾病的間接證據，而基于廣譜聚合酶鏈反應（PCR）技術的應用，允許對細菌進行特異性檢測和鑒定。事實上，分離和培養繁殖仍然是“黃金”方法，也是準確診斷的關鍵步驟[6]。

分離為研究新出現的細菌性疾病提供了一些不可替代的優勢，因為分離可以補充致病性分析，但也可以發展抗原研究、抗生素或替代化合物測試、敏感性實驗模型、遺傳研究和分類研究。在細菌診斷中，致病性試驗和生物測定是最后確認的必要條件，特別是在出現新的癥狀時，或在診斷檢疫細菌時。此外，分離允許建立用于維持細菌菌株的培養物集合。

利用以下方法分離細菌性植物病原菌：（1）選擇性培養基，以阻止或延遲非靶向腐生菌或污染細菌的生長；（2）添加了特定基質的培養基，該基質只能被目標細菌降解，該培養基能夠賦予生長菌落特定顏色[7]。

細菌鑒定階段包括基于不同生物學原理的至少兩項試驗（如生化、血清學和/或分子試驗的組合）或基于病原體基因組中不同DNA 序列靶點的兩項分子試驗。事實上，對一種可疑的植物細菌病原體的最終鑒定通常需要通過適當接種宿主植物進行致病性試驗。超敏反應試驗（HR）對某些病原菌（如植物病原假單胞菌和淀粉性歐文氏菌）是有用的，但對其他細菌種類則幾乎沒有反應[8]。

然而，傳統的檢測方法有一些缺點，如細菌培養通常需要數天或數周的時間，這在需要快速、高通量檢測的情況下是至關重要的。如果有必要區分密切相關的有機體（低特異性），可能很難根據單一的整體形態特征來區分細菌物種。如果植物材料中存在低負荷（低敏感性），則這些方法不允許檢測病原體。不同的論文討論了診斷技術的積極和消極方面，以及免疫和核酸技術相對于傳統診斷方法具有的優勢[9]。

2 分子方法

分子測試可以基于雜交或擴增技術，并且可以是高度特異的。大多數細菌病原體檢測方法檢測DNA，DNA 比RNA 更容易制備，也更穩定。

雜交技術利用探針作為單鏈DNA 或RNA 分子，用放射性同位素、酶或熒光染料等報告分子標記。探針識別目標樣本上的互補DNA/RNA序列，然后檢測信號。根據報告分子的類型，檢測步驟可能使用放射性或光（化學發光）。探針可以從雙鏈基因組、克隆或PCR 衍生的DNA 中產生。

近年來，分子診斷方法采用的PCR 技術比雜交技術更為靈敏、簡便、快速。也是在實驗室應用最多的檢測技術。然而，與單用PCR 相比，在基于PCR 的技術中集成探針可產生更敏感、更特異或更簡單的診斷方案。第一，傳統的實驗室PCR 檢測需要在反應后取出反應液，通過電泳后在紫外燈下觀察結果，這就避免不了污染的問題，導致結果產生假陽性，對文章下結論會產生一定的影響。而探針法在全封閉的條件下進行PCR 擴增和產物分析，這就大大避免了污染的可能性。第二，PCR 擴增經常會出現非特異性擴增和引物二聚體，從而影響對條帶的判斷，探針法通過特異性的探針雜交信號檢測產物，提高了檢測的準確性。

3 圖像光譜技術

光譜和成像技術在農業中的應用為植物病害的自動無損檢測提供了可能性。其中，熒光、多光譜或高光譜成像、紅外光譜、熒光光譜、可見/多波段光譜和核磁共振（NMR）光譜是用于植物病害檢測的植物細菌檢測方法。在植物細菌病害中，熒光光譜法被用來檢測柑橘潰瘍病引起的機械損傷。熒光參數的變化提供了病原體感染的指示。可見光譜和紅外光譜已被用作快速、無損、經濟的植物病害檢測。高光譜成像技術在精密農業和脅迫檢測中的應用正獲得越來越多的發展，不同的植物病原菌也報告了高光譜成像通過測量感染時生物物理和生化特性變化引起的反射變化[10]。高光譜圖像集樣品的圖像信息與光譜信息于一身，由于光譜信息能充分反映樣品內部的物理結構、化學成分，內部結構的差異可以通過特定波長的光譜值來表現。在每個特定波長下，xy平面內每個像素點的灰度值又與其在該波長下的光譜值之間一一對應。圖像信息可以反映樣品的形狀、缺陷等外部特征，由于不同成分對光譜吸收有不同的影響，在某個特定波長下圖像對某個缺陷會有較顯著反映，這些特點決定了高光譜圖像技術在農產品內外部品質的檢測方面的獨特優勢。許多研究人員利用分子方法配合光譜技術去驗證植物疾病的病原。

4 總結與展望

近年來，在植物病原檢測方面的一些研究使得新的開發方法能夠在更短的時間內獲得結果，如免疫試紙等，有時比傳統的微生物檢測具有更高的性能。然而，這些新方法需要驗證。通過早期發現來預防疾病的發展和傳播，是正確管理和控制疾病的一個有價值的策略。植物病害的檢測，應通過在野外開發新型傳感器系統，在早期快速、準確、可靠地進行。通過對受感染植物的早期診斷，可以避免疾病的傳播。無癥狀植物可以成為病原菌的貯存庫，發展具有提高敏感性、特異性的診斷方法，有助于植物病原菌的鑒定，即使在沒有疾病癥狀或明顯病原菌跡象的情況下。目前疾病診斷的突破在于光譜、成像技術和以揮發性有機代謝物作為生物標記物，隨著技術不斷發展，可以期待在植物細菌檢測領域的新投入診斷。新技術需要具備非侵入性和適用性。農民的興趣在于解決植物病害引起的問題，以快速、實時、無損的方法查明病害的感染情況，以便及時采取干預和預防措施，遏制感染，減少作物損失。

在不久的將來，開發、測試和完善可用于原位檢測植物病害的準確診斷方法，專為田間使用而設計新的植物病鑒定技術。但是，以可移動生物傳感器的形式進行采樣和使用該技術可能在邏輯上具有挑戰性。由于植物葉片具有龐大而復雜的基因組，可能難以獲得現場DNA 測序的專業知識。對于數據挖掘和分析，高通量計算生物學和信息學將至關重要。目前，沒有采取任何措施來改善可有效鑒定細菌植物病原體的可運輸DNA 測序生物傳感器。使用遙感設備進行測序將有助于識別多種細菌植物病原體，這是生物傳感器在植物病診斷中的一個重要研發方向。開發小型、經濟、高效、準確、簡單的儀器，使未經培訓的人員也可以在現場輕松地使用儀器去檢測細菌植物病成為現今的主流需求。