BKM120對紫杉醇耐藥卵巢癌細胞的抑制作用*

林城江，陳 冰

（上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院藥劑科，上海 200025）

卵巢癌為女性常見惡性腫瘤，Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者 經過手術及化學治療（簡稱化療）后，5年生存率僅20%～30%［1－5］。其常規化療一線藥物主要為紫杉醇類與鉑類藥物。多藥耐藥性（MDR）是細胞對一種藥物產生耐藥性的同時，對其他結構和作用靶點類似或不相同的抗腫瘤藥物也產生耐藥性［6－8］。P－糖蛋白（P－gp）過表達是研究最多的一種多藥耐藥機制，它是三磷酸腺苷（ATP）依賴性“藥泵”，多種多藥耐藥細胞均可過度表達P－gp，其水平與耐藥程度有關。YANG等［9］發現，P－gp和抗凋亡相關蛋白的過表達與卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥相關。磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）信號通路具有調節細胞增殖、分化、凋亡等多種功能，并參與腫瘤的多藥耐藥［10－12］。BKM120屬口服泛Ⅰ型PI3K抑制劑，作用于p110α，p110β，p110δ和p110γ，抑制細胞內Akt的磷酸化，在體內外抑制多種腫瘤細胞的生長［13－16］。紫杉醇耐藥卵巢癌細胞是以大劑量紫杉醇長期作用于卵巢癌A2780細胞后建立的具有穩定紫杉醇耐藥性細胞株，即A2780／Taxol細胞。雖有報道稱BKM120對卵巢癌A2780細胞增殖有明顯的抑制作用［17］，但尚無紫杉醇耐藥卵巢癌A2780／Taxol細胞的作用報道。本研究中探討了BKM120對A2780／Taxol細胞的抑制作用及作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

1.1.1 儀器

CX23型光學倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；371型氣套式CO2恒溫培養箱（美國Thermo Electron公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）；Sp－100UV型紫外分光光度計（英國Unicam公司）；Power Pac 200／MINI型通用電泳儀、MINI－Protean型電泳槽、Trans－Blot SD型半干轉膜儀（美國Bio Rad公司）；BX43型熒光正置顯微鏡（日本Olympus公司）；Tanon 4600型凝膠成像分析儀（中國上海天能科技有限公司）；1－14K型臺式低溫高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；SW－CJ－1B型凈化工作臺（中國蘇州凈化設備廠）。

1.1.2 試藥

BKM120（美國MCE公司）；順鉑（DDP，齊魯制藥有限公司）；青霉素（河南新鄉華星藥廠）；鏈霉素（吉林濟邦藥業有限公司）；紫杉醇（哈爾濱三聯藥業股份有限公司）；DMEM培養液、RPMI－1640培養液（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS，天津市灝洋生物制品科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI，美國Sigma公司）；MTT試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；P－Akt抗體、Akt抗體、Bcl－2抗體、Pro－caspase 3抗體、P－gp抗體、β－actin抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司）；SDS溶液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.3 細胞

卵巢癌A2780細胞、紫杉醇耐藥卵巢癌細胞A2780／Taxol（南京凱基生物科技發展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

取A2780細胞適量，培養于含10%FBS、100 U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素的DMEM培養液中；取A2780／Taxol細胞適量，培養于含10%FBS、100 U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素、800 ng／mL紫杉醇的RPMI－1640培養液中。2種細胞均在37℃及5%CO2培養箱中培養。每周進行2次傳代處理。

1.2.2 BKM120對細胞增殖的影響

采用MTT法。取對數生長期的2種細胞，分別制成密度為105mL－1的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔0.1 mL，設溶劑對照組和實驗①、②、③、④、⑤、⑥、⑦組。分別置37℃及5%CO2培養箱中培養24 h后加入經RPMI－1640培養液稀釋的BKM120，其終濃度分別為0，0.1，0.3，1.0，3.0，10.0，30.0，100.0μmol／L。藥物作用24，48，72 h后，每孔加入10μL 0.5%MTT溶液，繼續培養4 h。每孔加入100μL 10%SDS溶液，置37℃及5%CO2培養箱中培養過夜。采用酶聯免疫吸附檢測儀在570 nm波長處檢測吸光度值（OD）。平行操作3次，計算細胞增殖抑制率［（1－OD實驗組）／OD對照組×100%］。并計算半數抑制濃度（IC50）。

1.2.3 BKM120對細胞周期的影響

取對數生長期的2種細胞，分別接種到無菌6孔板中，培養過夜，貼壁。設溶劑對照組和實驗A，B，C，D組及DDP組，分別以終濃度為0，0.3，1.0，3.0，10.0μmol／L的BKM120和10.0μmol／L DDP培養液作用24 h，收集細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，并用70%乙醇在－20℃下固定過夜。離心，棄去固定液，然后用PBS洗滌細胞后重懸浮于含100μg／mL的PI，50μg／mL的RNA酶，0.1%的Triton X－100的PBS中，37℃，避光，染色30 min。采用流式細胞儀檢測，每份樣本采集105個細胞，結果用ModFit軟件進行分析。平行操作3次。

1.2.4 BKM120對細胞凋亡的影響

取2種細胞（3.5×105個／孔），分別接種于含高壓滅菌蓋玻片的6孔培養板中貼壁過夜。分組方法同1.2.3項下，加入不同濃度（0，0.3，1.0，3.0，10.0μmol／L）的BKM120和10μmol／L DDP，作用24 h后棄去培養液。PBS洗1次，加入4%多聚甲醛固定45 min，0.1%Triton X－100冰浴2～3 min，PBS洗滌2次，加入50μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min，以50%甘油封片，顯微鏡下放大200倍觀察細胞形態并拍照。平行操作3次。

1.2.5 BKM120對細胞中相關蛋白表達的影響

采用Western blot法。將2種細胞（106個／孔）接種于6孔板中過夜。分組方法同1.2.3項下，加入不同濃度（0，0.3，1.0，3.0，10.0μmol／L）BKM120和10μmol／L DDP處理24 h。吸除培養液，PBS沖洗，吸凈PBS，每孔加入100μL Trizol，冰上裂解20 min，收集細胞，置1.5 mL EP管中，4℃下12000 g離心5 min，取上清液，以Lowry法檢測蛋白含量。各組取50μg上樣，根據蛋白分子量以8%或12%SDS－PAGE電泳后半干轉，轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉（含0.1%吐溫20）室溫封閉1 h，加入一抗4℃封閉孵育過夜，TBST清洗4次，每次8 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫振搖2 h，回收二抗，用含0.1%吐溫20的TBST清洗4次，每次8 min。加入ECL化學發光試劑，將PVDF膜放入暗盒中，壓上X膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。以凝膠成像儀掃描，分析目的條帶與內參條帶的灰度比值，即為各目的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 BKM120對細胞增殖的抑制作用

用0.1～100μmol／L的BKM120處理A2780細胞和A2780／Taxol細胞24，48，72 h，1μmol／L BKM120作用24 h有明顯的增殖抑制作用，且隨著時間的延長作用增強。BKM120對A2780細胞的IC50為（2.25±0.13）μmol／L，對A2780／Taxol細胞的IC50為（4.17±0.43）μmol／L。詳見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率比較（±s，%，n＝3）Tab.1 Comparison of the inhibition rate of cell proliferation in each group（±s，%，n＝3）

表1 各組細胞增殖抑制率比較（±s，%，n＝3）Tab.1 Comparison of the inhibition rate of cell proliferation in each group（±s，%，n＝3）

注：與溶劑對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下表同。Note：Compared with those in the solvent control group，*P＜0.05，**P＜0.01，as well as the following tables.

A2780細胞 A2780／Taxol細胞組別濃度（μmol／L）00.10.31.03.010.030.0100.0溶劑對照組實驗①組實驗②組實驗③組實驗④組實驗⑤組實驗⑥組實驗⑦組24 h 00.00±0.000.43±2.4814.50±9.96**27.92±3.10**39.25±6.55**34.72±4.22**41.09±5.40**48 h 06.08±3.8716.31±3.71*30.25±1.58**58.58±1.86**78.18±1.87**76.24±1.40**81.29±2.05**72 h 00.90±1.013.20±3.5426.57±14.70**62.94±11.61**86.02±6.65**81.15±7.88**88.92±6.42**24 h 00.80±0.803.01±4.277.12±0.37*14.71±1.02**11.49±5.83*10.81±5.11**25.02±5.07**48 h 02.81±1.419.68±3.84*19.80±3.81**42.73±6.56**58.15±3.26**55.20±1.30**64.66±4.36**72 h 00.80±1.011.10±1.3413.52±4.41**51.53±9.50**70.83±0.72**73.73±1.60**79.58±1.78**

2.2 BKM120對細胞周期的影響

A2780細胞和A2780／Taxol細胞在BKM120作用24 h后出現G1期細胞減少，G2期阻滯，且具有劑量依賴性。從3.0μmol／L開始，實驗組與溶劑對照組G2期細胞數有顯著差異（P＜0.01）。詳見表2、圖1。

表2 各組細胞周期阻滯情況比較（±s，%，n＝3）Tab.2 Comparison of cell cycle arrest in each group（±s，%，n＝3）

表2 各組細胞周期阻滯情況比較（±s，%，n＝3）Tab.2 Comparison of cell cycle arrest in each group（±s，%，n＝3）

組別溶劑對照組實驗A組實驗B組實驗C組實驗D組DDP組濃度（μmol／L）00.31.03.010.010.0 A2780細胞 A2780／Taxol細胞G184.67±3.6687.47±0.9691.23±1.2646.61±5.81**49.30±5.40**56.63±8.34**S S 9.72±1.698.02±0.615.08±0.71*12.45±6.05*10.33±2.3340.31±6.83**G25.60±2.824.51±0.893.69±0.5640.93±3.71**40.38±6.12**3.06±1.52 G151.11±6.3151.03±7.6356.33±11.6621.72±8.10**21.17±7.84**25.50±5.87**29.14±6.5031.43±5.4928.18±7.1618.19±4.84**8.53±1.54**53.15±15.84**G219.75±9.8617.54±8.5315.50±6.4260.09±6.23**70.29±6.30**21.37±10.42

2.3 BKM120對細胞凋亡的誘導作用

BKM120作用于A2780細胞和A2780／Taxol細胞24 h后，細胞基因組DNA發生斷裂，末端3′－OH顯露出來，可在末端脫氧核苷酸轉移酶作用下添加熒光素標記的dUTP，顯微鏡下觀察呈現綠色熒光（見圖2）。BKM120誘導細胞凋亡呈劑量依賴性，經LSD－t檢驗，從0.3μmol／L開始，實驗組與溶劑對照組間有顯著差異（P＜0.01）。詳見表3。

表3 各組細胞凋亡率比較（±s，%，n＝3）Tab.3 Comparison of the apoptosis rate in each group（±s，%，n＝3）

表3 各組細胞凋亡率比較（±s，%，n＝3）Tab.3 Comparison of the apoptosis rate in each group（±s，%，n＝3）

組別溶劑對照組實驗A組實驗B組實驗C組實驗D組DDP組濃度（μmol／L）00.31.03.010.010.0 A2780細胞1.56±0.6615.09±3.34*23.76±3.78**42.00±3.84**43.28±2.22**19.92±2.14**A2780／Taxol細胞4.50±1.5912.29±6.07**18.20±3.55**29.58±4.33**30.79±4.54**17.69±2.03**

圖2 細胞光鏡圖a.solvent control group b－e.experiment groups A，B，C and D f.DDP group A.A2780 cells B.A2780／Taxol cellsFig.2 Light micrograph of cells

2.4 BKM120對細胞中相關蛋白表達的抑制作用

BKM120可下調P－Akt蛋白的表達，并呈濃度依賴性。3μmol／L BKM120作用于A2780細胞和A2780／Taxol細胞24 h能顯著降低P－Akt蛋白表達水平，但對Akt蛋白表達水平無影響；BKM120可顯著降低Bcl－2和Pro－caspase 3蛋白表達水平，說明BKM120能抑制Bcl－2蛋白表達，促進caspase 3蛋白表達。詳見圖3、表4。

2.5 BKM120對A2780／Taxol細胞中P－gp蛋白表達的抑制作用

BKM120下調P－gp蛋白的表達，并呈濃度依賴性。3μmol／L BKM120作用于A2780／Taxol細胞24 h能顯著下調P－gp蛋白表達。詳見圖3、表4。

表4 各組蛋白表達水平比較（±s，%，n＝3）Tab.4 Comparison of the expression levels of protein in each group（±s，%，n＝3）

表4 各組蛋白表達水平比較（±s，%，n＝3）Tab.4 Comparison of the expression levels of protein in each group（±s，%，n＝3）

組別溶劑對照組實驗A組實驗B組實驗C組實驗D組DDP組濃度（μmol／L）00.31.03.010.010.0 A2780細胞 A2780／Taxol細胞P－Akt／Akt 100.00±0.0080.24±4.0584.77±6.9667.67±5.21**43.20±3.74**82.57±3.28 Bcl－2100.00±0.0098.57±2.7685.68±3.1775.79±2.09*63.64±3.46*60.38±8.64**Pro－caspase 3100.00±0.0097.94±1.2696.99±1.7781.74±2.31*73.19±4.31**81.33±7.34*P－Akt／Akt 100.00±0.00102.10±6.6497.60±5.9654.26±2.16**46.15±1.46**84.44±2.98 Bcl－2100.00±0.0094.78±1.04102.80±1.7274.37±2.20*72.81±1.57**89.77±1.49 Pro－caspase 3100.00±0.0095.62±2.5188.15±2.6175.24±0.64**79.36±1.92**77.82±2.14**P－gp 100.00±0.0097.02±1.3398.19±1.7083.12±2.31*81.59±3.45*80.44±3.30*

圖3 蛋白電泳圖a.solvent control group b－e.experiment groups A，B，C and D f.DDP group A.A2780 cells B，C.A2780／Taxol cellsFig.3 Protein electrophoresis

3 討論

PI3K為一種由調節亞單位p85或p101和催化亞單位p110組成的脂激酶，通過催化PIP2，使其發生磷酸化，轉化為PIP3，激活下游Akt等［18］。Akt磷酸化活化使許多蛋白質磷酸化，調節細胞活動。研究表明，PI3K／Akt信號通路在多種惡性腫瘤中表達異常，如卵巢癌、乳腺癌、肝細胞癌、腎癌、前列腺癌、淋巴瘤等。在PI3K／Akt信號通路中涉及多個基因，如PIK3CA，Akt1，PTEN等發生突變［19－23］。

本研究結果表明，BKM120抑制A2780細胞和A2780／Taxol細胞的增殖，其作用呈劑量和時間依賴性，IC50均較低，說明其起始有效作用濃度較低，預示有較好的安全性；細胞周期檢測結果表明，BKM120可使大部分A2780細胞和A2780／Taxol細胞阻滯于G2期，降低腫瘤細胞的增殖速率；TUNEL熒光染色結果顯示，BKM120誘導A2780細胞和A2780／Taxol細胞的凋亡，并呈劑量依賴性，可顯著殺傷腫瘤細胞；Western blot實驗結果表明，BKM120下調了Akt蛋白磷酸化水平，轉運蛋白P－gp和抗凋亡蛋白Bcl－2在A2780／Taxol細胞中表達水平降低。另外，caspase 3的活化在凋亡發生的過程中發揮著重要作用。研究發現，BKM120下調了Pro－caspase 3的蛋白表達，表明BKM120通過抑制Akt蛋白的磷酸化，Bcl－2的表達和激活caspase 3誘導A2780／Taxol細胞凋亡，同時還有效抑制了轉運蛋白P－gp的表達，顯著減少了紫杉醇耐藥腫瘤細胞的藥物外排作用，為之后的聯合用藥提供了很好的條件。

綜上所述，BKM120可抑制A2780細胞和A2780／Taxol細胞的增殖，并通過下調Akt蛋白的磷酸化水平和抑制轉運蛋白P－gp的表達，降低Bcl－2蛋白表達水平，激活caspase 3誘導細胞凋亡。本研究為未來臨床使用BKM120治療耐藥卵巢癌提供了一定的理論依據。