長春西汀原料藥細菌內毒素檢查方法學研究*

陳 晨，裴宇盛，杜 穎，蔡 彤，高 華

（中國食品藥品檢定研究院，北京 102629）

長春西汀為長春花中提取的一種生物堿，臨床用于改善腦梗死后遺癥、腦出血后遺癥、腦動脈硬化癥等誘發的各種癥狀，具有起效快、耐受性好、不良反應小等特點，在腦血管疾病的治療中占有重要地位［1－2］。為避免長春西汀注射液在生產過程中帶來的質量風險，保證用藥安全，有必要嚴格控制其原料的細菌內毒素含量。長春西汀原料藥為白色晶狀粉末且幾乎不溶于水，需使其溶解至澄清溶液后再進行細菌內毒素檢驗，否則不溶性微粒中可能包裹細菌內毒素導致假陰性結果［3］。受企業委托，根據2015年版《中國藥典（四部）》附錄1143細菌內毒素檢查法的要求，對其原料藥細菌內毒素的測定進行方法學研究，為該類產品的質量控制提供參考，進而對如何溶解不溶性樣品，溶解后是否對試驗造成干擾，以及難溶性樣品陽性對照如何制備等問題提供了新的解決思路?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AE240型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Vortex－Genie2型渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；ELX－808型細菌內毒素測定儀（美國BioTek儀器公司）；WNE45型恒溫水浴鍋（德國Memmert公司）。

1.2 試藥

長春西汀原料藥（河南潤弘制藥股份有限公司，批號代號分別為A，B，C）；0.1 mol／L鹽酸標準滴定溶液（中國食品藥品檢定研究院）；酒石酸（湖南爾康制藥股份有限公司，批號為102620180401）；鱟試劑（廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號為171211，檢測限為0.005～50 EU／mL；湛江安度斯生物有限公司，批號為1802052，靈敏度為0.03 EU／mL；廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號為18011001，靈敏度為0.03 EU／mL）；細菌內毒素國家標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150800－201601，單支效價為9000 EU）；細菌內毒素檢查用水（廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號為171211；湛江安度斯生物有限公司，批號為1810260）；Tris緩沖液（湛江安度斯生物有限公司，批號為1808240）。

2 方法與結果［4－5］

2.1 限值確定

藥品的細菌內毒素限值（L）＝K／M，式中，K為人每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU／（kg·h）表示，M為人用每1 kg體質量每1 h的最大供試品劑量，以mL／（kg·h）、mg／（kg·h）或U／（kg·h）表示，長春西汀原料藥供生產注射劑使用，以注射劑的K值為5 EU／（kg·h）計算，人均體質量按60 kg計算，則成人每1 h最大可接受的內毒素劑量為300 EU；依據長春西汀注射液說明書要求，成人一次最大給藥劑量為30 mg，溶入500 mL 0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液緩慢滴注（＜80滴／分），則樣品內毒素限值為（300 EU－0.5 EU／mL×500 mL）÷（30 mg÷3）＝5 EU／mg；為嚴格控制成品質量，依據從嚴原則，企業期望將長春西汀原料細菌內毒素的L擬訂為每1 mg長春西汀原料藥中含內毒素的量應小于1.67 EU。

2.2 光度測定法

2.2.1 標準曲線可靠性驗證試驗

按藥典細菌內毒素檢查法規定，進行鱟試劑的標準曲線可靠性試驗，動態顯色法鱟試劑經細菌內毒素國家標準品檢查，結果均符合規定。

2.2.2 干擾試驗及供試品內毒素含量檢測

1）樣品溶液制備

取長春西汀原料藥適量，精密稱定，加入細菌內毒素檢查用水溶解，制成含長春西汀20 mg／mL的樣品溶液。若長春西汀溶解性差，可置37℃恒溫水浴中加熱助溶，或加入適量助溶劑。

2）有效稀釋倍數（MVD）計算

公式為MVD＝L×C／λ。式中，L為長春西汀的細菌內毒素限值（1.67 EU／mg），C為樣品溶液質量濃度（20 mg／mL），λ為鱟試劑標示靈敏度（0.005 EU／mL）。則長春西汀的對應最大有效稀釋倍數為，MVD0.005＝1.67（EU／mg）×20（mg／mL）／0.005（EU／mL）＝6680倍。本試驗中選擇稀釋1000倍進行檢測。

3）試驗操作

標準曲線：取細菌內毒素國家標準品，用細菌內毒素檢查用水50，5，0.5，0.05，0.005 EU／mL系列標準品溶液，每個濃度做2個平行孔檢測。使用0.1 mL標準內毒素＋0.1 mL動態顯色法鱟試劑進行檢測。以細菌內毒素濃度（C）對數值（lg C）為橫坐標，達預設吸光度（OD）值反應時間（T）對數值lg T為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程lg T＝6.18－0.225 lg C。

樣品溶液：取2.2項下3批次的樣品溶液，加適量0.1 mol／L鹽酸溶液，使樣品溶液呈澄清液體，以稀釋劑（如Tris緩沖液）調pH為6.0～8.0，先使用細菌內毒素檢查用水將長春西汀稀釋100倍后，再用Tris緩沖液稀釋10倍。樣品溶液做2個平行孔，使用0.1 mL樣品溶液及0.1 mL動態顯色法鱟試劑檢測。取3個批次的長春西汀原料藥，分別與酒石酸銨1∶0.5（m／m）取樣，用細菌內毒素檢查用水溶解，制成含長春西汀20 mg／mL的樣品溶液，置37℃恒溫水浴中加熱助溶并振蕩，同法加入Tris緩沖液稀釋并調pH為6.0～8.0。樣品溶液做2個平行孔，使用0.1 mL樣品溶液及0.1 mL動態顯色法鱟試劑檢測。

樣品回收溶液：采用預先添加標準內毒素的方法，取2種助溶劑配制的含20 mg／mL的長春西汀溶液0.1 mL，分別加入10μL 5000 EU／mL細菌內毒素標準溶液，用細菌內毒素檢查用水溶解，置37℃恒溫水浴中加熱助溶并振蕩，用細菌內毒素檢查用水稀釋100倍，然后再用Tris緩沖液稀釋10倍。使細菌內毒素的最終含量為0.5 EU／mL，再加入0.1 mL鱟試劑，做回收率檢測，每個稀釋度的樣品回收溶液做2個平行孔，使用0.1 mL樣品回收溶液及0.1 mL動態顯色法鱟試劑檢測。

陰性對照：以細菌內毒素檢查用水作陰性對照，做2個平行孔，使用0.1 mL陰性對照及0.1 mL動態顯色法鱟試劑檢測。

4）試驗結果

結果見表1。使用鹽酸為助溶劑的樣品回收率不在50%～200%間，認為在此試驗條件下樣品溶液存在干擾；使用酒石酸為助溶劑的樣品回收率符合規定，且內毒素含量小于限值要求，3批樣品均符合規定。

表1 長春西汀內毒素檢測結果Tab.1 Results of the endotoxin test of vinpocetine

2.2.3 高酸度對細菌內毒素的影響

上述試驗未考察高酸度對樣品本身所含內毒素的影響，故模擬預先添加內毒素的方法，驗證在添加2種助溶劑時的酸度（0.1 mol／L的鹽酸和10 mg／mL的酒石酸）是否會破壞細菌內毒素，對試驗造成干擾，從而影響結果。

1）試驗操作

標準曲線：同2.2.2試驗操作項下方法，得回歸方程lg T＝6.05－0.228 lg C（r＝0.999）。

樣品溶液：取0.1 mol／L的鹽酸和10 mg／mL的酒石酸溶液先用細菌內毒素檢查用水稀釋1000倍，作為樣品溶液，樣品溶液做2個平行孔，使用0.1 mL樣品溶液及0.1 mL動態顯色法鱟試劑檢測。

樣品回收溶液：取0.1 mol／L的鹽酸和10 mg／mL的酒石酸溶液各0.1 mL，分別加入10μL 5000 EU／mL的細菌內毒素標準溶液，用細菌內毒素檢查用水溶解，用細菌內毒素檢查用水稀釋1000倍，使最終細菌內毒素含量為0.5 EU／mL，再加入0.1 mL鱟試劑，做回收率檢測，每個稀釋度的樣品回收溶液做2個平行孔，使用0.1 mL樣品回收溶液及0.1 mL動態顯色法鱟試劑檢測。

陰性對照：同2.2.2項下方法進行試驗。

2）試驗結果

鹽酸助溶劑回收率（8.90%）不在50%～200%間，認為0.1 mol／L的鹽酸可能會破壞細菌內毒素，對檢測結果有影響，而10 mg／mL的酒石酸（回收率132.9%）則對細菌內毒素無破壞作用，樣品內毒素濃度＜5 EU／mL。

2.3 凝膠法

2.3.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

按藥典細菌內毒素檢查法規定，進行鱟試劑的標示靈敏度復核，結果見表2。2批鱟試劑經細菌內毒素國家標準品檢查，λC結果均符合規定。

表2 鱟試劑靈敏度復核Tab.2 Recheck results of the sensitivity of tachypleus amebocyte lysate

2.3.2 干擾預試驗

樣品溶液配制：將長春西汀和酒石酸按1∶0.5（m／m）稱定質量，用細菌內毒素檢查用水溶解，制備成含長春西汀20 mg／mL、酒石酸10 mg／mL的樣品溶液。若長春西汀溶解性差，可置37℃恒溫水浴中加熱助溶。

MVD計算：公式為MVD＝L×C／λ。式中，L，C，λ均同2.2.2項下公式，目前市售產品通常為0.03～0.5 EU／mL。樣品溶液的對應最大有效稀釋倍數為，MVD0.5＝1.67（EU／mg）×20（mg／mL）／0.5（EU／mL）＝66.8倍，同法計算，MVD0.25，MVD0.125，MVD0.06，MVD0.03分別為133.6，267.2，534.4，1068.8倍，選用120，240，480，960倍4個稀釋倍數進行試驗。

試驗操作：取2.2.2項下樣品溶液，用細菌內毒素檢查用水稀釋至120倍，再使用Tris緩沖液將樣品溶液分別稀釋240，480，960倍，將該系列濃度溶液記為NPC。同時加入細菌內毒素標準溶液，使其均含有2λ的細菌內毒素，記該系列溶液為PPC。取2個不同廠家的鱟試劑（批號分別為1802052，1801011），分別與上述PPC和NPC進行反應，每個濃度重復2管，并設陽性對照（PC）和陰性對照（NC）。

試驗結果：結果見表3。3批長春西汀原料至少需稀釋至480倍（即長春西汀質量濃度為0.042 mg／mL）對2個廠家的鱟試劑均無干擾作用。

表3 長春西汀干擾預試驗結果Tab.3 Results of the interference pre－test of vinpocetine

2.3.3 干擾試驗

取2.2.2項下樣品溶液，用細菌內毒素檢查用水稀釋120倍，然后再用Tris緩沖液稀釋480倍，按藥典中的“細菌內毒素檢查法 凝膠法干擾實驗”項，使用靈敏度為0.03 EU／mL的鱟試劑進行試驗，結果見表4。表中Es和Et分別為系列標準溶液、樣品溶液反應終點濃度的幾何平均值。正式干擾試驗結果表明，3批樣品對2個廠家鱟試劑的Es和Et均在0.5λ～2.0λ范圍內，均符合鱟試劑靈敏度復核的要求，確認在480倍（質量濃度為0.042 mg／mL）稀釋下無干擾作用。且內毒素含量均小于1.67 EU／mg，符合企業期望的質量標準。

表4 樣品溶液的干擾試驗結果（EU／mL）Tab.4 Results of the interference test of sample solution（EU／mL）

2.3.4 細菌內毒素檢查

分別選擇上述2個廠家靈敏度為0.03 EU／mL的鱟試劑，樣品稀釋480倍，L按小于1.67 EU／mg為判定標準，對上述3批長春西汀原料藥細菌內毒素進行檢查，結果見表5。結果，3批樣品均符合規定。

表5 樣品溶液的細菌內毒素檢查結果Tab.5 Results of the bacterial endotoxin test of sample solution

3 討論

長春西汀原料藥幾乎不溶于水，酸性助溶劑能增加其溶解性，預試驗中以鹽酸作助溶劑使其成為澄清溶液，但動態顯色法試驗結果表明回收率低于50%，對試驗造成干擾，發現是由于鹽酸的酸性太強，使用Tris緩沖液稀釋后無法將其pH調至內毒素試驗要求范圍內，因此不能作為該樣品的助溶劑。

通過研究長春西汀注射液的工藝發現，其采用酒石酸作為助溶劑，因此本試驗中以酒石酸溶解長春西汀原料藥，試驗結果未受干擾，符合細菌內毒素光度測定法的要求，且樣品內毒素含量遠低于企業期望限值?？紤]到全國對細菌內毒素檢測方法的使用現狀，又進行了凝膠法研究，結果表明，在酒石酸的助溶下，長春西汀原料需稀釋至480倍時（長春西汀質量濃度為0.042 mg／mL），對2個廠家的鱟試劑均無干擾作用，使用0.03 EU／mL的鱟試劑所建立的方法可用于長春西汀原料藥的細菌內毒素檢查，故長春西汀原料藥采用細菌內毒素檢查是可行的，可采用細菌內毒素檢查法進行質量控制，確定其質量標準為限值應低于1.67 EU／mg。

對于難溶樣品，為準確檢測出細菌內毒素含量，需尋找一種能完全溶解樣品的方法，從而進行后續研究，因此溶解樣品的方法尤為重要。目前溶解難溶性樣品的方法包括加熱、乳化、萃取、離心，以及加入適合的助溶劑等，需根據樣品本身的特性，盡量尋找不對試驗產生干擾的方法，如需選擇助溶劑溶解，應首選制劑輔料相關的試劑。此外，還應注意藥典中相關規定，為了確保溶解樣品的方法能有效地排除干擾且不會使內毒素失去活性，應預先添加標準內毒素再稀釋樣品進行干擾試驗，在確定無干擾后，再進行細菌內毒素檢查，為了方便試驗，在未改變試驗條件的情況下，也可使用后加標準內毒素的方法制備陽性對照。本研究中對長春西汀原料藥細菌內毒素測定進行方法學研究，為進一步對難溶性藥物的細菌內毒素方法學研究提供了參考。