白藜蘆醇對模型大鼠心肌梗死后心力衰竭的改善作用*

熊劍濤，張春龍，張詩銳，郭 琴，周承毅△，孫 娟

（1.湖北省恩施華龍總醫院急診醫學科，湖北 恩施 445000； 2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院重癥醫學科，湖北 恩施 445000； 3.湖北民族大學醫學部，湖北 恩施 445000）

近年來，心力衰竭（HF）的發生率逐漸升高。在美國，每年新增HF病例超過500萬，其中死亡病例27萬［1］。目前，我國HF患者數已達420萬，成人患病率超0.9%［2］。HF是多種內外因素綜合作用的結果，如心肌損傷或機械負荷過重會激活交感神經系統，引發多種細胞因子的產生。同時，心肌中的信號轉導通路也會被激活，隨后心肌細胞會發生一系列的病理變化，如心肌代償性肥大［3］。白藜蘆醇（3，5，4′－三羥基二苯乙烯）屬非黃酮類多酚化合物，具有抗癌、抗血管生成、免疫調節、心臟保護和抗氧化活性的藥理學作用［4］。白藜蘆醇通過下調Toll樣受體4（TLR4）和核因子－κB（NF－κB）表達，減輕模型大鼠局灶性腦缺血后的炎癥、血腦屏障破壞和腦損傷，對腦缺血模型大鼠發揮神經保護作用［5］；同時能改善糖尿病模型大鼠的心功能，抑制心肌細胞凋亡，參與改善線粒體功能［6］。本研究中探討了白藜蘆醇通過TLR4／NF－κB信號通路對模型大鼠急性心肌梗死后心力衰竭（HFMI）的改善作用，為白藜蘆醇治療HF提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

1.1.1 儀器

BX 60型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；iMark680型多功能酶標檢測儀、凝膠成像系統、蛋白電泳儀（美國Bio Rad公司）；MyLabTMSix型彩色多普勒超聲診斷儀（意大利Esaote公司）；FrescoD－37520型臺式冷凍高速離心機（美國Sorvall公司）；7500型PCR儀（美國ABI公司）；HWS28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.1.2 試藥

白藜蘆醇（美國Sigma－Aldrich公司，批號為36227353，純度≥99.9%）；非諾貝特（法國利博福尼制藥公司，批號為H20181239）；白細胞介素6（IL－6）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號為21423472）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）ELISA試劑盒（批號為2022848）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒（批號為20672942）和丙二醛（MDA）ELISA試劑盒（批號為20790242），均購自上海紀寧實業有限公司；RIPA裂解液（批號為P0013B）、特超敏ECL化學發光試劑盒（批號為P0018AS），均購自上海碧云天生物技術有限公司；TLR4，NF－κB，GAPDH抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；HE染色劑、辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；TUNEL凋亡檢測試劑盒（德國Roche公司，批號為6432344001）。

1.1.3 動物

40只SD大鼠，雄性，體質量（210±20）g，購自湖北民族大學動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK（鄂）2019－0012。所有大鼠于鼠房適應環境，喂養1周。

1.2 方法

1.2.1 模型復制及分組、給藥

將40只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、白藜蘆醇組和非諾貝特組，各10只。腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg／kg）麻醉大鼠，仰臥保定，氣管插管，連接呼吸機、麻醉劑及心電監護儀。模型組、白藜蘆醇組和非諾貝特組大鼠無創性線結扎冠狀動脈左前降支，隨后可見結扎線下方心肌顏色發白、心電圖出現S－T改變及Q波，即為急性心肌梗死模型復制成功。假手術組大鼠僅穿線，不結扎。術后2周，大鼠射血分數（EF）＜55%，即為HF模型復制成功［7］。建模成功后，大鼠灌胃給藥，白藜蘆醇組予白藜蘆醇（30 mg／kg）［8］，非諾貝特組予非諾貝 特（100 mg／kg）［9］，假 手 術 組 和 模 型 組 予 等 體 積0.9%氯化鈉溶液。每天1次，持續4周。

1.2.2 左心室功能監測

末次給藥24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg／kg）麻醉大鼠（下同），監測大鼠左室舒張末期內徑（LVEDd）、左室收縮末期內徑（LVESd）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV），并計算EF、縮短分數（FS），至少連續監測3個心動周期。

1.2.3 心肌結構觀察

麻醉大鼠，取出心臟，用4%多聚甲醛固定左室組織72 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，常規二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木素（H）染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化數秒，流水洗滌后，伊紅（E）液浸染3 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。于光學顯微鏡下放大400倍觀察。

1.2.4 IL－6，TNF－α，SOD，MDA水平檢測

末次給藥后，麻醉大鼠，尾靜脈取血，1000 g離心20 min，取血清，按ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中IL－6，TNF－α，SOD，MDA水平。

1.2.5 心肌細胞凋亡觀察

取1.2.3項下心肌石蠟切片，常規脫蠟，PBS漂洗，3%過氧化氫浸洗10 min，加入蛋白酶K工作液，37℃反應20 min，PBS漂洗后，滴加TUNEL反應混合液，37℃孵育1 h。PBS漂洗，加入轉化劑，37℃孵育20 min。PBS漂洗，DAB顯色。中性樹膠封片。于光學顯微鏡下放大400倍觀察。

1.2.6 TLR4和NF－κB蛋白表達水平檢測

按1.2.3項下方法進行心臟取材。把心臟組織剪切成細小碎片，以RIPA裂解液裂解組織，離心，取上清液，BCA法測定蛋白含量。取30μg蛋白上樣，10%SDS－PAGE電泳后濕法電轉至PVDF膜上，10%脫脂奶粉封閉，隨后加入TLR4（1∶3000）抗體、NF－κB（1∶3000）抗體和GAPDH（1∶5000）抗體，4℃孵育過夜。加入HRP標記二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液至膜上，化學發光成像儀檢測。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 左室心功能

與假手術組比較，模型組大鼠EF和FS顯著降低，LVEDd和LVESd顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇組和非諾貝特組大鼠的EF和FS顯著升高，LVEDd和LVESd顯著降低（P＜0.01）。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心功能比較Note：Compared with those in the sham operation group，＃P＜0.01；compared with those in the model group，*P＜0.01；as well as Fig.3 to Fig.6.A.Left ventricular structure map（HE，×400）B.Data statistics of cardiac function indexesFig.1 Comparison of cardiac function of rats in each group

2.2 心肌結構

假手術組大鼠心肌細胞排列整齊，模型組大鼠心肌細胞肥大且排列紊亂，白藜蘆醇組和非諾貝特組大鼠心肌細胞排列趨于整齊。詳見圖2。

圖2 各組大鼠心肌結構圖（HE，×400）Fig.2 Myocardial structure map of rats in each group（HE，×400）

2.3 炎性指標

與假手術組比較，模型組大鼠血清中IL－6和TNF－α水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇組和非諾貝特組大鼠血清IL－6和TNF－α水平顯著降低（P＜0.01）。詳見圖3。

圖3 各組大鼠炎性指標比較A.IL－6 B.TNF－αFig.3 Comparision of inflammatory indexes of rats in each group

2.4 氧化應激指標

與假手術組比較，模型組大鼠血清中SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇組和非諾貝特組SOD水平顯著升高，MDA含量顯著降低（P＜0.01）。詳見圖4。

圖4 各組大鼠氧化應激指標比較A.SOD B.MDA Fig.4 Comparision of oxidative stress indexes of rats in each group

2.5 心肌細胞凋亡情況

與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇組和非諾貝特組大鼠心肌細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。詳見圖5。

圖5 各組大鼠心肌細胞凋亡情況A.Cardiomyocyte map B.Data statisticsFig.5 Cardiomyocyte apoptosis of rats in each group

2.6 TLR4和NF－κB蛋白表達水平

與假手術組比較，模型組大鼠血清中TLR4和NF－κB蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，白藜蘆醇組和非諾貝特組大鼠血清中TLR4和NF－κB蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。詳見圖6。

圖6 各組大鼠TLR4和NF－κB蛋白表達水平A.Electrophoretic map B.Data statisticsFig.6 The expression levels of TLR4 and NF－κB protein of rats in each group

3 討論

HF在老年患者中非常普遍，即使接受了最佳的藥物治療，但5年內死亡率仍很高［10－11］。目前的藥物治療可預防新發性HF的發生，延緩HF的進展，但對多數接受治療的患者來說，預后欠佳，出院后90 d內，再住院率高（35%）［12］。

白藜蘆醇能顯著改善心肌梗死模型大鼠的EF，減少心肌梗死引起的左室重構和心房重構，恢復脂肪酸氧化水平，顯著改善心肌能量代謝［13－14］。此外，白藜蘆醇能顯著抑制壓力超負荷誘導的小鼠心肌肥厚、纖維化和心肌細胞凋亡，改善模型小鼠心功能［15］。本研究結果顯示，白藜蘆醇可明顯改善HFMI模型大鼠的心功能，改善心肌結構。白藜蘆醇還可抑制模型大鼠的心肌細胞凋亡。

氧化應激和炎癥在多種疾病的進展中發揮著重要作用。研究表明，白藜蘆醇可改善糖尿病并HF模型大鼠的心血管功能，顯著抑制炎性因子和氧化應激標志物MDA的產生［16］。白藜蘆醇對高脂飲食引起的腎損傷具有保護作用，提高腎臟抗氧化酶活性，降低腎臟MDA，TNF－α，IL－6水平［17］。本研究結果顯示，白藜蘆醇可降低HFMI模型大鼠血清中IL－6，TNF－α，SOD，MDA水平，從而發揮抗炎和抗氧化作用。

Toll樣受體屬跨膜蛋白，在先天免疫中起關鍵作用。NF－κB是調節生理過程、炎性反應和凋亡的重要轉錄因子。黃芪甲苷通過抑制TLR4／NF－κB通路而抑制心肌細胞凋亡［18］，白藜蘆醇通過抑制TLR4／NF－κB信號通路，降低氧化應激和細胞凋亡，在腎缺血再灌注損傷中發揮保護作用［19］。本研究結果顯示，白藜蘆醇可抑制HFMI模型大鼠TLR4和NF－κB蛋白的表達水平。

綜上所述，白藜蘆醇可改善模型大鼠HFMI狀態，其機制可能與抑制TLR4／NF－κB通路有關。