碘克沙醇注射液細菌內毒素檢查法質量標準修訂建議

范治云，劉 瑞，趙 巖，肖 英，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗研究院·國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室，山東 濟南 250101）

碘克沙醇注射液屬X線對比劑，目前國內外幾個廠家執行的細菌內毒素檢查法質量標準（YBH03522014，YBH01492018，YBH06512010，JX20190104）均有差異，如揚子江藥業集團有限公司、南京正大天晴制藥有限公司、江蘇恒瑞醫藥股份有限公司、GE Healthcare Ireland Limited的細菌內毒素限值（L）分別為0.05 EU／100 mg、0.672 EU／mL、0.16 EU／mL、0.0025／0.0021 EU／mg（270／320 mg／mL），方法分別為凝膠法、動態顯色法、濁度法、顯色基質法，給該品種的監督檢驗和質量控制帶來不便。本研究中擬統一碘克沙醇注射液細菌內毒素的檢查限值和檢查方法，并分別用凝膠法和動態濁度法進行檢查方法適用性研究，為該品種更有效的質量控制及國家標準修訂提出建議。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PKF96－4K－2296型細菌內毒素檢測儀（美國ACC公司）。

1.2 試藥

碘克沙醇注射液（廠家A，揚子江藥業集團有限公司，批號為1908206，規格為50 mL∶13.5 g，批號為19112161和19111861，規格為50 mL∶16 g；廠家B，南京正大天晴制藥有限公司，批號分別為2002261，1910241，2002271；廠家C，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號分別為191202DJ，190921DJ，191204DJ；廠家D，GE Healthcare Ireland Limited，批號分別為14749091，14891355，14895222，后3個廠家的規格均為100 mL∶32 g）。細菌內毒素檢查用水（BET用水，批號為160006－201805，內毒素含量≤0.003 EU／mL），細菌內毒素工作標準品（批號為150601－201784，效價為每支80 EU），均購自中國食品藥品檢定研究院。鱟試劑（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，批號為1906062。湛江安度斯生物有限公司，批號為1904103、規格為每支0.1 mL、靈敏度為0.06 EU／mL，批號為2001161、規格為每支0.1 mL、靈敏度為0.015 EU／mL）。動態比濁法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號為1908210，可測內毒素范圍為0.01～10 EU／mL，規格為每支1.25 mL）。

2 方法與結果［1］

2.1 細菌內毒素限值（L）確定

L＝K／M，式中，K為人每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，M為人用每千克體質量每小時最大劑量。按碘克沙醇注射液藥品說明書最大劑量為150 mL（48 g碘），注射劑的K為5 EU／（kg·h），成人按60 kg計，計算M得2.5 mL／（kg·h），即碘800 mg／（kg·h），L值為0.00625 EU／mg。現有標準是企業標準上升到國家標準，而企業標準出于內控需要和安全考慮而制定的限值更嚴格。故根據現有國家標準，并遵照標準從嚴的原則，將L確定為4個廠家標準中最嚴格的0.0005 EU／mg。

2.2 凝膠法干擾試驗

2.2.1 樣品干擾預試驗

目前在售鱟試劑靈敏度（λ）為0.5～0.015 EU／mL，參考文獻［2］，本品內毒素有干擾情況，4個廠家各抽取1批，用BET用水將樣品稀釋成120，60，30 mg／mL的系列樣品溶液（對應的鱟試劑λ分別為0.060，0.030，0.015 EU／mL），分別用2個廠家的鱟試劑考察上述系列濃度稀釋液的干擾情況，每個濃度做2管，同時做陰性對照（NC）和標準對照，結果4個廠家的樣品在30 mg／mL質量濃度下對試驗均無干擾。詳見表1。

2.2.2 樣品干擾試驗

用BET用水將細菌內毒素工作標準品制成2.0λ，1.0λ，0.5λ，0.25λ，即0.125，0.060，0.030，0.015 EU／mL的系列標準品溶液；并制備含有上述4種濃度細菌內毒素的質量濃度為30 mg／mL的樣品稀釋液，分別用2.2.1項下2個廠家的鱟試劑考察4個廠家12批樣品在30 mg／mL的干擾情況，每個濃度平行4管，同時做陰性對照和標準對照。結果反應終點幾何平均值為0.5λ～2.0λ，表明樣品在30 mg／mL質量濃度下可消除對試驗的干擾因素。詳見表2。

表2 碘克沙醇注射液凝膠法細菌內毒素干擾試驗結果Tab.2 Results of bacterial endotoxin interference test of Iodixanol Injection by the gel method

2.2.3 樣品細菌內毒素檢查

采用λ為0.015 EU／mL的鱟試劑，對4個廠家的12批樣品進行細菌內毒素檢查，結果均小于0.0005 EU／mg。

2.3 動態濁度法干擾試驗

2.3.1 細菌內毒素標準曲線的建立和可靠性分析

用BET用水將細菌內毒素標準品進行稀釋，使最終細菌內毒素濃度分別為1.25，0.25，0.05，0.01 EU／mL，各取0.1 mL，分別加到預先加有0.1 mL鱟試劑的反應管內，混合均勻，以細菌內毒素檢測儀檢測，每個濃度平行3管，結果見表3。標準曲線回歸方程為lg T＝－0.31 lg C＋2.89，r＝－0.996（｜r｜應大于0.980），平行管之間的RSD均小于10%，NC反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，故細菌內毒素標準曲線成立。

表3 動態濁度法細菌內毒素平均反應時間（n＝3）Tab.3 The mean reaction time of bacterial endotoxin by KTA（n＝3）

2.3.2 干擾試驗

根據標準曲線內毒素濃度的設置，選擇0.25 EU／mL作為靠近曲線中點的內毒素濃度（λm），4個廠家各取1批樣品，用BET用水稀釋成60，30，20，15，10 mg／mL的系列樣品溶液（A液），同時制備含上述樣品濃度并含內毒素濃度為λm（0.25 EU／mL）的溶液（B液），分別取上述各溶液0.1 mL，加到預先加有0.1 mL鱟試劑的反應管內，混合均勻并測定，每個濃度平行2管。測定結束后，儀器按標準曲線回歸方程自動計算出樣品溶液和含標準內毒素λm的樣品溶液的內毒素含量，以及該試驗條件下的回收率（R）。結果表明，20 mg／mL質量濃度及以下回收率在50%～200%。詳見表4。

表4 動態濁度法干擾試驗結果（n＝2）Tab.4 Results of the interference test by KTA（n＝2）

2.3.3 動態濁度法樣品細菌內毒素檢查

取4個廠家共12批樣品，同法制備20 mg／mL濃度的稀釋液（A液）和含相同樣品濃度及標準內毒素λm（0.25 EU／mL）的溶液（B液），每個濃度平行2管，測定［2］。結果，標準曲線回歸方程為lg T＝－0.30lg C＋2.90（r＝－0.995），B液的回收率均在50%～200%，樣品結果均符合規定。詳見表5。

表5 動態濁度法樣品細菌內毒素檢查結果（n＝2）Tab.5 Results of the bacterial endotoxin test of samples by KTA（n＝2）

3 討論

目前，碘克沙醇注射液生產廠家執行的質量標準各不相同。本研究結果表明，采用凝膠法和動態濁度法對4個廠家的樣品進行細菌內毒素干擾試驗，并按限值0.0005 EU／mg對12批樣品分別進行檢查，結果均符合藥典規定。說明本品可采用統一的標準進行質量控制。

本研究結果顯示，不干擾濃度，即最小有效稀釋質量濃度凝膠法為30 mg／mL，動態濁度法為20 mg／mL。結果的細微差異可能與2種方法的觀察判斷標準不同有關，前者以倒轉180°管內形成凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；后者是檢測反應混合物的濁度達到某一預先設定的吸光度所需反應時間。此種現象常見于樣品有干擾的情況［3－6］。凝膠法操作簡單，觀察結果直觀，對儀器要求度低；動態濁度法檢測靈敏度高，需要特定儀器和更高靈敏度的鱟試劑［7－11］。2種方法均適用于碘克沙醇注射液細菌內毒素的檢查。

綜上所述，2種方法均適用于碘克沙醇注射液細菌內毒素的檢查。但凝膠法必須用λ為0.015 EU／mL的鱟試劑進行檢查，故建議該品種細菌內毒素的檢查限值設為0.0005 EU／mg，統一采用動態濁度法。