CRISPR/Cas9在自身免疫性疾病中的應用

陳振宇

（福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117）

免疫反應被抗原激活后，在消滅抗原的同時，甚至當抗原已被清除后，激活的淋巴細胞凋亡延遲，且將自身組織當作靶抗原予以殺傷，產生自身免疫性疾病。自身免疫性疾病臨床表現多樣，發病機理未明，尚缺乏理想治療方法。臨床治療方案除控制發病誘因外，主要采用抑制或阻斷體內病理性自身免疫應答方法，如激素類藥物、抗風濕藥物、免疫抑制劑等，但這些藥物無法徹底根治。隨著以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術的崛起，許多疾病有望通過基因治療讓患者獲得痊愈，而且近年來與自身免疫相關的基因，細胞因子和信號通路相繼被發現，這為治療自身免疫性疾病提供了很多新的思路。

1 CRISPR/CAS9系統簡述

1.1 CRISPR/CAS9的發現

早期，研究者們認為像細菌和古細菌這樣的單細胞生物只有簡單的免疫防御機制，而缺乏“記住”病原體的能力。然而，Ishino等[1]發現在大腸桿菌的堿性磷酸酶基因編碼區下游存在一段由長度為29 bp的重復片段和32～33 bp的非重復片段間隔相連的重復序列，之后的研究發現這種重復結構在細菌和古細菌中普遍存在[2]。21世紀初，該結構被正式定義為Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats(CRISPR)。CRISPR/Cas系統類似于真核生物的適應性免疫系統，能夠“記住”之前攻擊過細菌的病原體，并在病原體再次攻擊宿主時迅速建立有效的反應，清除病原體[3]。在CRISPR/Cas發現后不久，科學家開始使用各種CRISPR/Cas系統進行實驗性基因改造，并最終用于基因治療，如今，CRISPR/Cas被認為是開發針對疾病（如癌癥、單基因疾病和自身免疫性疾病）分子療法最有前途的工具之一[4]。

1.2 CRISPR/CAS9的結構

作為一種適應性免疫系統，CRISPR/Cas系統的存在使得原核生物可以“記住”那些來自病毒或者噬菌體的外源DNA，然后阻止這些DNA在原核生物體內的復制[5]，從而防止原核生物再次受到相同外源DNA的攻擊，類似于真核生物中的RNAi系統[6]。2007年，在嗜熱鏈球菌中首次發現CRISPR作為適應性免疫系統的證據，該項研究表明，CRISPR間隔區的序列與特定噬菌體基因組序列之間的序列同源性是CRISPR系統發揮作用的前提[7]。此外，又證明了新的間隔重復單位是在被噬菌體攻擊之后獲得的，并且cas基因轉錄的產物是CRISPR系統功能不可缺失的一部分。

一個典型的CRISPR/Cas基因序列由三個部分組成。分別是CRISPR序列，間隔重復序列以及cas基因序列。CRISPR序列在不同原核生物基因組中的數量可能有所不同，但每個CRISPR位點之前都含有一個富含AT的不保守的前導序列[8]，長度從幾個堿基對到一百個堿基對不等。該序列對于CRISPR的轉錄至關重要，缺乏前導序列的CRISPR片段沒有顯示出能夠獲得新的間隔重復單位的能力[9]。

CRISPR 序列的第二部分是由間隔重復序列組成，每個單位都有一個間隔重復序列，在不同的物種、菌株，甚至在同一基因組的不同位點之間都有所不同，其后緊連著一個與病毒基因組中原間隔序列相同的間隔序列。每個序列重復間隔單元的數量從幾個到幾百個不等，目前已知的最高數量的重復間隔單元是氯氟烴屬植物基因組中的374個[10]。

cas 基因構成了CRISPR基因序列的第三部分。這些基因通常位于重復序列之后，并增加了CRISPR系統的可變性，因為每個基因集群都有不同的cas基因集。迄今為止，已鑒定出40多個cas基因家族，其中六個cas基因家族存在于幾乎所有具有CRISPR序列（Cas1至Cas6）的物種中，因此被稱為“核心”cas基因。

1.3 CRISPR/Cas9的作用機制

CRISPR 功能分為三個階段：適應、CRISPR RNA的形成和干擾。在第一階段，當外源DNA入侵細菌時，其CRISPR系統會特異性地捕獲一段被稱為proto-spacers的外源DNA序列插入到前導序列與間隔重復序列之間，并進行一次重復片段的復制，形成一段新的重復單元，這些重復單元就是細菌特異性免疫的結構基礎。值得注意的是，外源DNA的捕獲并不是完全隨機的，在這些被捕獲的DNA序列下游通常有一段序列保守的特殊結構，被稱為PAM位點[11]。PAM位點的存在可能是CRISPR系統區分自身DNA與外源DNA而避免發生自身免疫的機制之一[12]，同時也是基因編輯時靶序列選擇的重要需求[13]。在第二階段，形成的重復單元會被轉錄形成前體CRISPRRNA(Pre-crRNA)，在RNAseⅢ的作用下成熟。成熟的crRNA與tracrRNA通過堿基配對形成雙鏈RNA結構，Cas9蛋白結合形成靶向切割復合體對外源DNA進行特異切割，達到識別和降解外源DNA的目的。

2 CRISPR/Cas9技術在自身免疫性疾病中的應用

2.1 CRISPR/Cas9用于篩選自身免疫性疾病調控基因

CPISPR/Cas9 有望用于治療單基因疾病和大多數自身炎癥性疾病。自身免疫性疾病的遺傳背景復雜，多基因多通路參與發病機制，且易受外部環境的影響，CRISPR/Cas技術誘導基因失活已經在多個研究領域得到應用。

有研究表明Treg細胞的不穩定則會促進自身免疫或更多更有效的抗腫瘤免疫，其主要特征表現為主要轉錄因子Foxp3的缺失及促炎性特性的獲得。在一項研究中，研究人員開發出了一種用于初級小鼠Treg細胞表型研究的基于CRISPR的聯合篩選平臺，同時研究人員利用該技術對大約500個核內因子進行了靶向功能缺失的篩選分析，從而識別出能促進或干擾Foxp3表達的基因調節程序[14]。此外，有研究團隊使用CRISPR全基因組篩選技術，在T1D（1型糖尿病）小鼠模型中利用自身免疫的選擇性壓力在自身免疫性糖尿病中進行無偏倚的全基因組搜索，以尋找胰島β細胞存活的修飾因子[15]。

許多遺傳變異與自身耐受性的喪失及自身免疫的發展有關。研究發現在一些自身免疫性疾病患者的樣本中發現了數百種遺傳變異，其中約90%存在于非編碼區和免疫增強子[16]。具有順式調節和表觀遺傳特征的非編碼區的遺傳調控受損是自身免疫性疾病的主要基礎，證明這些變異是否是免疫功能的假定控制因子的一個潛在方法是使用CRISPR進行序列微干擾，該方法已被用于識別功能性非編碼區[17]。這些區域中的一些序列作為增強子，可能對免疫調節至關重要，對特定的細胞外環境或刺激做出反應。基于CRISPR的實驗也能用于識別這些重要的自身免疫風險基因座的調控序列，如CD69和IL2RA，后者與克羅恩病有關[18,19]。此外，CRISPR篩選也被用于PD-1和PD-L1的假定調節因子的研究[20]。

2.2 CRISPR/Cas9用于構建自身免疫性疾病模型

CRISPR 亦被運用于某些疾病模型的構建。例如，一組研究人員創建了家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥2（FHL2）模型，以測試在無法進行骨髓移植時，與間充質基質細胞共同培養作為替代療法的效果[21]。利用CRISPR對自身免疫調節因子基因（AIRE）也進行了研究，揭示了AIRE的干擾導致自身免疫的機制之一是通過破壞胸腺髓質上皮細胞（mTECs）與胸腺細胞之間的粘附[22]。

在另一項研究中[23]，研究人員運用CRISPR/Cas9技術制備了Trex1D18N/D18N點突變小鼠，該小鼠展現出了許多人類自身免疫的癥狀，包括生存時間顯著下降，心臟、腎臟的多個器官受損，自身抗體增加等。利用CRISPR/Cas9技術建立的這些自身免疫性疾病模型對后續的藥物開發和臨床應用具有重要意義。

2.3 CRISPR/Cas9用于自身免疫性疾病治療

有一些免疫系統的疾病是由單基因紊亂引起的，例如周期性發熱綜合征、原發性免疫缺陷和某些自身免疫性疾病等可以用CRISPR來進行治療，這些疾病中的大多數都是由于生殖系中的基因變異引起的，使得造血干細胞能夠產生基因變異的祖細胞和成熟細胞。因此，異基因干細胞移植通常是嚴重聯合免疫缺陷（SCID）[24]或慢性肉芽腫性疾病的治療方法，然而，時常發生移植物抗宿主的情況，可能會對預后產生負面影響。通過使用CRISPR，可以在患者自身的造血干細胞中進行基因修飾，插入正常的基因拷貝，然后產生自體移植的細胞庫，可以在沒有移植物抗宿主風險的情況下重建免疫系統的功能[25]。

類似的方法也被用于鐮狀細胞病。在一項研究中，來自HBB基因有純合錯義突變的SCD患者的iPSCs通過CRISPR與含有野生型HBB等位基因的DNA模板進行同源重組修飾，使得常規的β珠蛋白可以正常表達[26]。

在分化的免疫細胞也可以通過CRISPR進行突變糾正。IL2RA的隱性突變導致一個有自身免疫性疾病家族史的患者FOXP3 Tregs中IL2受體α鏈處于低水平狀態，一項研究在利用CRISPR進行靶向修飾后，患者的T細胞開始表達正常水平的IL2RA[27]。

CRISPR 修飾的Tregs過繼細胞療法也是治療自身免疫性疾病的方法之一。在模式動物中，類風濕性關節炎通過進行的Treg移植，顯示出改善的跡象；然而，在人類RA患者中嘗試這種方法之前，維持Treg的分化是一個重要的問題。CRISPR/Cas系統也被用于修飾可能影響FOXP3表達的基因，使得Treg的表型占優勢，并促進了類風濕性關節炎過繼Treg治療的效果[28]。

另外一項最新的成果中，研究人員運用CRISPR/Cas9技術對A20進行了研究[29]，結果表明A20去泛素化酶（DUB）結構域的遺傳變異增加了系統性紅斑狼瘡（SLE）和類風濕性關節炎的風險。A20由基因TNFAIP3進行編碼，是NF-κB的負調節劑，DUB結構域可以通過結構變化來降低或增加NF-κB活性[30-32]，因此可以對NF-κB誘導的促炎和存活基因表達進行調節，但是有其他報道表明A20的DUB活性對其NF-κB抑制功能并不是必要的[33]。因此，由A20 DUB結構域的遺傳破壞引起的自身免疫風險增加可能是由NF-κB途徑以外的其他機制引起的。

利用CRISPR/Cas對表觀遺傳進行調控也被用于治療自身免疫性疾病。Jing等人通過CRISPR/Cas序列干擾開發了一種具有miR-155表達沉默的巨噬細胞細胞系，在該細胞系中，促炎細胞因子的表達顯著降低，這種方法可能是治療類風濕性關節炎的一種途徑[34]。生物藥物的常規抗細胞因子治療通常由于在非靶組織中的抑制而具有副作用。然而，使用CRISPR/Cas9，Brunger等人實現了生物藥物的閉環生產。研究人員利用CRISPR/Cas9技術將IL1R拮抗劑和STNFR 1-鼠IgG的基因插入鼠iPSC CCL2基因的位點。在炎癥過程中，CCL2表達對白細胞介素-1和腫瘤壞死因子-α的反應。當細胞暴露于炎癥信號時，細胞因子拮抗劑的表達減輕了白細胞介素-1和腫瘤壞死因子α的體外病理生理效應[35]。

3 總結與展望

2020 年10月，瑞典皇家科學院宣布，將2020年諾貝爾化學獎授予Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna，以表彰她們在“憑借開發基因組編輯方法”方面作出的貢獻，意味著此項技術迎來了一個嶄新的時代，它將會逐漸地滲入人類的日常生活和醫療健康，如可以用于提高部分農產品的抗病性和產量，不需要再利用雜交選種的方式。它為疾病建模、基因篩選以及基因沉默、插入、干細胞修飾和表觀遺傳修飾等領域提供了一種簡單且廉價的方法，讓科學家們在各自的領域有了新的方向和突破。雖然這項技術為科學研究提供了諸多便利，由于自身免疫性疾病多與遺傳相關，且多基因多通路參與發病機制，CRISPR可能是通過使用針對自身免疫性疾病患者的個性化藥物來實現疾病治愈的有力治療手段之一，但需要注意的是單基因的敲除是否會影響機體其他功能的缺失或者導致其他疾病，所以對于CRISPR/Cas9在自身免疫性疾病中的應用還需要進一步深入研究，以利用此項技術的最大潛力來開發針對特定疾病的個性化治療方法。