乳腺癌急性放射性皮炎中自噬相關基因Beclin1的表達及臨床意義

楊 丹，劉夢瑤，陳 勇

（南華大學附屬邵陽醫院血液腫瘤科，湖南 邵陽 422000）

據世界衛生組織國際癌癥研究機構發布的最新數據顯示，2020年女性乳腺癌發病率已一躍成為全球首位。放療（放射治療）在減少乳腺癌復發的同時也為提高患者的生存率做了一定的貢獻。急性放射性皮炎是放療開始后90 天以內出現的皮膚黏膜的炎癥性損傷，可表現為紅斑、脫皮、出血、潰瘍或局部壞死等。目前對于放射性皮炎的評判標準主要有三種，臨床上最常用的評判標準是RTOG 標準[1-2]。在RTOG 標準中，急性放射性皮炎可分為5 級，0 級為皮膚無反應組，1-2級為輕度放射性皮炎組（輕度皮炎組）,3-4 級為重度放射性皮炎組（重度皮炎組）。

Beclin1 基因是首個被鑒定的哺乳動物自噬相關基因，細胞內的自噬活動在正常條件下處于較低水平，然而在細胞因子、缺氧等的作用下可迅速增強。研究表明，自噬能夠通過抑制細胞凋亡、抗細胞氧化等來參與皮膚挫傷、光損傷及燒傷等的活動進展。相關研究表明，急性放射性皮炎的機制研究主要與炎癥反應、膠原蛋白的變化、活性氧的產生、DNA 的損傷等有關[3]，而皮膚挫傷、光損傷及燒傷等的病理生理過程與放射性皮炎有著許多相似之處。因此，本文通過研究乳腺癌接受放射治療的患者皮膚組織中Beclin1 蛋白的表達情況，分析其與急性放射性皮炎的關系，初步探討Beclin1 基因在放射性皮炎中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月1日至2021年06月10日在邵陽市中心醫院乳甲外科收治和病理科存檔的73 例需進行放療的乳腺癌患者皮膚組織蠟塊及患者臨床資料，其中皮膚無反應組21 例，輕度皮炎組30 例，重度皮炎組22 例。各組年齡，體重等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），如表1。

1.2 檢測方法

免疫組化（酶標記聚合物技術）所有乳腺癌皮膚組織取4μm 厚度切片，經固定、脫水、包埋、脫蠟后，用檸檬酸鈉緩沖液修復法進行抗原修復，然后加入辣根過氧化物酶阻斷試劑來抑制內源性過氧化物酶，后滴加一抗Beclin1（兔抗人單克隆抗體，長沙維世爾生物科技有限公司，按照1：300 稀釋），生物素來標記二抗，PBS

(磷酸鹽緩沖液)反復沖洗后，最后滴加DAB 顯色劑，蘇木素復染色，1%鹽酸水溶液分化，不飽和碳酸鋰返藍，脫水，透明，干燥，封片，顯微鏡下讀片。用PBS 代替一抗來作陰性對照。既往研究表明，Beclin1 表達于細胞胞漿中。

1.3 結果判斷

使用免疫積分判斷標準記錄染色強度：未著色:0 分，淡黃色:1 分，黃色:2 分，棕褐色:3 分。從整個切片中任選5 個高密度視野（×100）進行評分，每個視野計數100 個細胞。按照染色比例計分≤10%:1 分，10%<染色比例計數≤50%:2 分，＞50%:2 分。由兩位病理科專家在對臨床資料不知情的前提下進使用半定量積分法進行判斷。半定量積分法是指染色強度與染色比例的相乘積分，半定量積分≤3:陰性，＞3 分:陽性。

1.4 統計學方法

SPSS26.00 軟件，計數資料采用百分百(%)表示，乳腺癌患者皮膚組織中Beclin1 蛋白的表達率使用卡方檢驗，P<0.05 有統計學意義，P<0.01 有顯著差異。

2 結果

2.1 Beclin1 在放射性皮炎組織中的表達

如表1及圖1所示，Beclin1 在皮膚基底細胞胞漿中表達，皮膚無反應組中Beclin1 蛋白陽性表達率為76.19%，輕度皮炎組中Beclin1 蛋白陽性表達率為46.67%，重度皮炎組中Beclin1 蛋白陽性表達率為13.64%，三組對比差異有統計學意義（P<0.05），表明在放射性皮炎的三個組別中的Beclin1蛋白陽性表達有可比性。

2.2 Beclin1 的表達與急性放射性皮炎的關系

將皮膚無反應組、輕度皮炎組及重度皮炎組中Beclin1的表達率進行兩兩對比，如表1所示，皮膚無反應組中Beclin1 的表達率明顯高于輕度皮炎組，差異有統計學意義（P<0.05）；皮膚無反應組中Beclin1 的表達率明顯高于重度皮炎組，有顯著性差異（P<0.01）；輕度皮炎組中Beclin1 的表達率明顯高于重度皮炎組，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

據國家癌癥中心統計報道，中國女性乳腺癌每年發病率居女性惡性腫瘤首位，死亡率居女性惡性腫瘤第四位[4]。放療聯合其他治療手段，能降低局部區域的復發率、腫瘤遠處轉移風險等，最終影響總死亡率。

自噬借助溶酶體降解大分子物質，回收利用基本構件，進行物質周轉，參與維持內環境的穩態[5]。自噬泡后成核并延長，募招受損大分子物質形成自噬體，并與溶酶體結合成自噬溶酶體[6]。Beclin1 是自噬關鍵調控分子，其編碼的Beclin1蛋白編碼約450 個氨基酸，包含進化保守結構域（ECD)、Bcl-2 同源－3(BH3）結構域、中央卷曲螺旋結構域(CCD）三個結構域。通過與III 類磷酸肌苷－3－激酶VPS34 結合參與募集蛋白質，誘導自噬的啟動。同時介導其他自噬蛋白的定位及上下游蛋白的調控，進而調控自噬體的形成及成熟[5]。

在大鼠皮膚挫傷的研究中發現，皮膚損傷后隨著時間的延長，細胞自噬增加，提示細胞自噬可能參與了皮膚損傷后修復、愈合過程[7]。研究證實miR-506-3p 在燒傷組織的真皮成纖維細胞中顯著下調，檢測表明Beclin1 是miR-506-3p 的直接靶點，引入Beclin1 可拮抗miR-506-3p 過表達對成纖維細胞增殖、自噬和分子間表達的抑制作用[8]。

當皮膚受到放射性刺激時，活性氧的產生增加或清除下降，其不斷積累造成皮膚基底細胞增殖分化及基底層向角質層遷移過程受限。細胞能夠產生抗過氧化物質阻斷活性氧對皮膚組織氧化損傷，維持氧化反應的平衡。研究發現放射線能氧化脂質，導致細胞膜及線粒體膜受損，引發細胞中水分丟失，毛細血管擴張，皮膚出現紅斑、腫脹等損害，同時活性氧能促使DNA 結構及功能紊亂及其不程度的丟失，生成大量核酸內切酶胸腺嘧啶乙二醇和間接反應DNA 損傷的8－羥基鳥嘌呤。自噬能及時清除氧化受損的細胞器，提高細胞存活率[9]。有關研究表明，神經生長因子缺乏時，活性氧不斷蓄積，當敲除Beclin1 與Atg 7 后，活性氧蓄積增加，自噬參與了減少神經細胞活性氧蓄積進展活動[10]。本研究中，Beclin1 在皮膚基底細胞胞漿中表達，Beclin1 蛋白在細胞胞漿中的定位與其自噬功能相關，考慮Beclin1 參與的自噬可能在急性放射性皮炎中發揮作用。在皮膚無反應組中Beclin1 的表達率明顯高于輕度皮炎組，差異有統計學意義（P<0.05）；皮膚無反應組中Beclin1 的表達率明顯高于重度皮炎組，有顯著性差異（P<0.01）；輕度皮炎組中Beclin1 的表達率明顯高于重度皮炎組，差異有統計學意義（P<0.05），在輕度皮炎組中Beclin1 參與自噬活動顯著增加，可能是早期干預了氧化應激活動，從而參與減輕炎癥的發展活動。

在自噬光損傷研究中，敲除自噬相關基因beclin1、Atg5后，皮膚組織對于紫外線照射誘導的細胞凋亡更為敏感，提示自噬具有抑制細胞凋亡并提高細胞的存活率的作用[11]。細胞凋亡是機體受刺激后及時清除多余及受損細胞的程序性過程，參與機體的細胞更新。放射線可引起Bcl-2 及Ras 等凋亡抑制基因的低表達，凋亡誘導基因的過表達，引發細胞凋亡。抑制Bcl-2 可引起線粒體膜腫脹，釋放出活性物質細胞色素C，其和半胱氨酸蛋白酶9 形成凋亡體，引起半胱氨酸蛋白酶9 自我活化與剪切，裂解活化半胱氨酸蛋白酶3 來切割底物，導致蛋白級聯切割放大，最終引起細胞凋亡[12]。Beclin1 基因的BH3 結構介導與Bcl-2/Bcl-XL 的相互作用，形成的復合體對于自噬活動有負反饋調節作用。半胱氨酸酶1 是一種具有多種功能的高遷移率基群核蛋白B1，半胱氨酸酶1 在活性氧的誘導下容易被氧化，氧化的半胱氨酸酶1 抑制beclin1 與Bcl-2 的相互作用，以促進自噬的過程，從而及時清除受損細胞器保護細胞[13]。

綜上，Beclin1 可能通過通過清除活性氧及抑制細胞凋亡等參與了皮膚損傷組織的修復,從而及時干預急性放射性皮炎的進展。早期干預Beclin1 陰性的乳腺癌需放療的患者，可能對治療放射性皮炎起到一定的作用，Beclin1 有望成為急性放射性皮炎的治療靶點，目前對于自噬對急性放射性皮炎的影響仍未得到完全闡述，自噬調節炎癥性反應及細胞因子的產生的關系尚未明確，仍需要進一步的研究來闡明自噬參與急性放射性皮炎的明確機制，以期對急性放射性皮炎的預測、預防、治療產生治療作用。