ARHI通過Wnt/自噬通路調控口腔鱗癌細胞凋亡的研究

李建豪，呂少華，李吉辰，樸松林

0 引言

口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見的頭頸部惡性腫瘤[1]，約占全球人類癌癥總數的1%～3%，在口、咽惡性腫瘤中約占90%，且發病率有逐年增高趨勢[2]。OSCC中以舌鱗癌最多見，后者惡性程度高，嚴重威脅人類健康[3]。在過去的30年內，盡管早期診斷、誘導化療、功能性手術及輔助放療等對OSCC的治療取得了長足的進步,但OSCC患者的5年生存率仍然維持在50.0%～55.0%[3-4]。因此，新的OSCC診斷標志物以及預后相關因子的發現尤為重要。

自噬是真核細胞主要的降解途徑之一，屬于程序性細胞死亡[5]。大量研究表明，自噬與腫瘤的發生發展密切相關[6-9]。

Aplasia-Ras同源物成員I(Aplasia ras homolog I,ARHI)又稱DIRAS3，是與Ras相關的母體印跡腫瘤抑制基因，已有研究表明，ARHI在膠質瘤[10]、卵巢癌[11]、乳腺癌[12]以及OSCC[13]中低表達，但ARHI對OSCC生物學活性的作用以及潛在的作用機制有待研究。

本研究通過生物信息學、免疫組織化學、Western blot等方法，探討ARHI在OSCC中的表達情況，驗證ARHI能否通過Wnt信號通路調控OSCC細胞凋亡，誘導自噬，從而為OSCC的臨床治療提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料 所有材料均選自2016-2019年于哈爾濱醫科大學口腔醫院行OSCC根治術的20例OSCC石蠟組織標本，并收集20例癌旁健康組織作為對照。鱗癌組織標本中男性10例，女性10例；高分化10例，中分化5例，低分化5例。患者年齡30～72歲，平均(48.0±8.5)歲。所有患者均未接受過術前放療或化療，且排除其他部位患有原發性癌癥。所有材料均符合哈爾濱醫科大學倫理委員會的規定，患者均簽署知情同意書。

1.2 數據分析

1.2.1 數據來源 使用的OSCC數據集從美國國家生物技術信息中心(NCBI)基因表達綜合總線(GEO)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載。原始基因表達譜從GSE9844和GSE75540數據集獲得。使用R包affy和Annotate處理原始數據，制作表達矩陣并使探針與它們的基因符號匹配，R包sva用于組合和校正兩個數據集。使用UALCAN數據庫篩選ARHI在頭頸部鱗癌中的表達。

1.2.2 差異基因的篩選 如果存在重復的基因，則采用平均值。隨后使用微陣列數據線性模型(LIMMA)封裝來篩選OSCC樣品和對照樣品之間的DEG。調整后的P值<0 .01和|對數倍數變化(FC)| > 1/2作為篩選標準。

1.2.3 共表達基因和富集分析 使用GEPIA數據庫查找ARHI的共表達基因。隨后，使用Metascape數據庫富集ARHI的共表達基因。

1.3 所需試劑 ARHI過表達質粒(銳博生物，中國)，ARHI、β-catenin、GSK-3β、Bcl-2、Caspase-3、LC3、Beclin-1以及β-actin(CST，美國)，吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)(Solarbio Biotechnology，中國)，mRFP-GFP-LC3腺病毒(漢恒生物，中國)。

1.4 細胞轉染 ARHI過表達質粒購自銳博生物有限公司，使用專用的轉染試劑轉染ARHI 48 h后，檢測不同過表達質粒的ARHI蛋白表達。

1.5 免疫組化分析 所有標本均用10%中性甲醛溶液浸泡固定，常規脫水后用石蠟包埋，切片機連續切片，切片厚度為4 μm，每5張去1張。進行免疫組化染色，ARHI抗原均采用免疫組化DAB 染色法，嚴格按照兔抗人ARHI單克隆抗體試劑盒說明書進行。然后使用DAB進行顯色。經自來水洗滌、蘇木精復染、乙醇脫水、二甲基苯透明后，將切片用樹脂固定，置顯微鏡下觀察。石蠟切片由我院2名病理學家在未知腫瘤級別的情況下進行雙盲閱片。

1.6 Western blot分析 Western blot分析檢測過表達ARHI后，CAL-27和SCC-115細胞中凋亡以及自噬相關蛋白的變化。將含有蛋白酶抑制劑以及細胞裂解液(1∶50)加入轉染后的細胞中，通過BCA(碧云天，中國)檢測蛋白濃度。在80 V電壓下恒壓電泳1.5 h后，200 mA恒流轉印2 h，之后在5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后將轉印好的硝酸纖維素膜與相應的一抗(β-catenin、GSK-3β、Bcl-2、Caspase-3、LC3、Beclin-1以及β-actin)在相宜的濃度下進行結合，然后置于4 ℃搖床中孵育過夜。清洗硝酸纖維素膜后，用陽離子化辣根過氧化物酶(CHRP)結合二級抗體(山羊抗兔1∶2 000，中國中山金橋)孵育1 h。然后在紫外光下顯影，用圖像分析系統檢查。

1.7 吖啶橙/溴化乙錠熒光染色 分別將過表達ARHI以及其對照轉染于CAL-27和SCC-115細胞中48 h。隨后將細胞與吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)(Solarbio biotechnology，China)按1∶1的比例培養5 min。采用以下公式計算凋亡細胞百分比：凋亡率(%)=凋亡細胞數/計數細胞總數×100%。

1.8 免疫熒光檢測細胞自噬 將過表達ARHI以及ARHI對照組分別轉染到CAL-27和SCC-115細胞中，然后感染mRFP-GFP-LC3腺病毒。12 h后更換培養基，24 h后采集熒光圖像。GFP和mRFP熒光共定位，表明一個小室沒有與溶酶體融合；沒有GFP的mRFP信號表明一個小室已經與溶酶體融合。

2 結果

2.1 ARHI基因在頭頸部鱗癌中的表達 通過GEPIA數據庫，頭頸部鱗癌患者組織的ARHI mRNA表達譜結果顯示，與健康樣本相比，ARHI在頭頸部鱗癌患者中表達降低(P=0.038)(圖1A)。UALCAN數據庫檢測頭頸部鱗癌患者不同亞組分析數據集，證明頭頸部鱗癌患者組織與正常樣本相比，ARHI的表達明顯降低(圖1B)。在頭頸部鱗癌患者中，不同病理學分級、年齡、種族以及腫瘤分期的ARHI基因具有差異表達(圖1C-1F)。不同人種中不同ARHI表達水平的頭頸部鱗癌患者的生存時間也不相同(P=0.047，圖2)，這些結果表明，ARHI參與了頭頸部鱗癌的惡性進展，影響患者生存。

圖2 UALCAN數據庫比較不同人種、不同ARHI表達水平的頭頸部鱗癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.2 ARHI基因在OSCC中低表達 利用整合表達譜(GSE9844和GSE75540)對OSCC癌和癌旁組織進行比較，篩選出68個差異基因。通過在P值和FC之間繪制DEG來構造“火山圖”。芯片圖中顯示了差異基因表達的熱圖。結果顯示，ARHI基因表達降低(圖3A)。同時，與癌旁組織相比，OSCC癌組織中的ARHI基因表達顯著降低(P=0.027，圖3B)。20例免疫組化結果顯示，ARHI在OSCC中表達降低(P=0.035，圖3C)。

圖3 ARHI在OSCC組織中的表達注：A.整合GSE75540以及GSE9844芯片數據后的熱圖；B.ARHI在OSCC中的mRNA表達；C.ARHI在OSCC患者組織中蛋白表達(免疫組化)。*與對照組比較，P<0.05

2.3 過表達ARHI抑制OSCC細胞增殖活性并誘導細胞凋亡 過表達ARIⅡ后，在CAL-27以及SCC-115細胞中ARHI明顯升高(P=0.042，圖4A)細胞增殖活性明顯降低(P=0.035，圖4B)，而空質粒組的細胞增殖活性相對于正常組沒有任何改變(P=0.083，圖4B)。相對于正常對照組，過表達ARHI組的細胞凋亡率明顯升高(P=0.027，圖4C)。過表達ARHI能夠明顯使Bax蛋白升高(P=0.035，圖4D)，同時Cleaved-caspae-3/Caspae-3的表達也升高(P=0.029，圖4D)。以上結果表明，OSCC細胞中過表達ARHI能夠抑制細胞增殖活性，誘導凋亡。

圖4 過表達ARHI對于口腔鱗癌細胞增殖活性的影響注：A.Western blot 檢測過表達ARHI后CAL-27、SCC-115細胞中ARHI蛋白的表達；B.CCK-8檢測過表達ARHI后CAL-27、SCC-115細胞的增殖活性變化；C.AO/EB檢測過表達ARHI后，CAL-27以及SCC-115細胞凋亡的變化；D.過表達ARHI后CAL-27、SCC-115細胞中Bax蛋白及 Cleaved-caspase-3/Caspase-3的表達。*與對照組比較，P<0.05

2.4 OSCC細胞中過表達ARHI對于Wnt信號通路的影響 在GEPIA數據庫中找到了200個ARHI共表達基因，使用Metascape進行富集分析，發現這些途徑主要集中在葉酸生物合成、Wnt信號轉導、小分子轉運和翻譯后蛋白磷酸化(圖5A)。而Wnt 信號通路是參與OSCC惡性進展的經典通路之一。為了進一步探討Wnt 信號通路在ARHI參與OSCC惡性進展中的作用，我們檢測了過表達ARHI后Wnt信號通路的經典蛋白GSK-3β以及β-catenin的變化，發現過表達ARHI后，GSK-3β的蛋白表達上調(P=0.035，圖5 B)，且β-catenin蛋白表達明顯降低(P=0.031，圖5 C)。以上結果表明，過表達ARHI后能夠調控Wnt 信號通路，進而誘導OSCC細胞凋亡。

圖5 過表達ARHI對CAL-27以及SCC-115細胞中Wnt信號通路的影響注：A.ARHI在OSCC中可能的作用通路；B.過表達ARHI后CAL-27以及SCC-115細胞中GSK-3β蛋白的變化；C.過表達ARHI后CAL-27以及SCC-115細胞中β-catenin蛋白的變化。*與對照組比較，P<0.05

2.5 OSCC細胞中過表達ARHI促進細胞自噬 為了進一步確定過表達ARHI誘導OSCC細胞凋亡的途經，我們通過透射電鏡檢測了CAL-27以及SCC-115細胞中自噬小體的變化。結果顯示，相對于正常組，過表達ARHI后，CAL-27以及SCC-115細胞中自噬小體數量明顯增多(P=0.043，圖6A)。采用免疫熒光法檢測LC3在過表達ARHI后的變化，結果顯示，相對于正常對照組，LC3表達明顯增多(P=0.044，圖6B)。隨后，通過Western blot方法檢測CAL-27以及SCC-115細胞中自噬相關蛋白的變化，結果顯示，過表達ARHI后，能夠使Beclin-1及LC3II/I表達升高(P=0.031，P=0.042，圖6C)。以上結果表明，自噬參與了過表達ARHI誘導OSCC細胞凋亡。

圖6 過表達ARHI對CAL-27、SCC-115細胞中自噬相關因子的影響注：A.透射電鏡顯示自噬小體；B.免疫熒光顯示LC3表達；C.自噬相關蛋白LC3II/I以及Beclin-1的表達

3 討論

越來越多的研究發現，ARHI在多種惡性腫瘤中異常表達[13]。然而，ARHI在OSCC中的作用尚未明確。本研究首先通過GEPIA以及UALCAN數據庫證明了ARHI在頭頸部鱗癌中低表達，同時，通過整合GEO芯片數據，發現ARHI在OSCC中低表達，且免疫組化結果進一步證明了ARHI在OSCC中低表達。通過分子生物學方法，過表達ARHI能夠調控Wnt信號通路經典蛋白，進而使細胞自噬增加，誘導OSCC細胞凋亡，提示ARHI可能是治療OSCC的新靶點。

細胞凋亡和自噬是兩個重要的過程，在生理和病理上維持細胞內穩態，兩條通路之間可能發生串擾。以往的研究表明，細胞的自噬可以通過消除潛在毒性大分子和受損細胞器進而參與細胞活性的調控[14]。此外，一些自噬與OSCC的研究發現，OSCC細胞自噬能夠誘導其細胞凋亡[8-9,15]。本研究中，我們發現ARHI在OSCC組織中低表達，且影響OSCC患者的生存期。而細胞凋亡與腫瘤惡性進展密切相關[16]。隨后我們的實驗結果表明，過表達ARHI后，在CAL-27以及SCC-115細胞中觀察到自噬現象，包括自噬小體增多、LC3II/I的表達升高、Beclin-1的表達水平增加。本研究的結果表明，過表達ARHI可能通過促進OSCC細胞自噬導致細胞凋亡。此前，Wei等[17]曾報道Genipin通過PI3K/AKT/mTOR途徑誘導OSCC細胞自噬和抑制細胞生長。同時，Chen等[18]證明Erianin誘導OSCC細胞凋亡和自噬。這也進一步印證了我們之前的結果。因此，ARHI在癌細胞的生物學功能依賴細胞自噬。進一步研究結果表明，ARHI在OSCC中是通過促進OSCC細胞自噬，進而發揮多種生物學功能的。

Wnt信號通路在OSCC的惡性進展中發揮著重要作用[19]，并且參與調控細胞自噬[20]。本實驗結果表明，過表達ARHI后，能夠使細胞自噬增加，誘導細胞凋亡。目前，ARHI促進細胞自噬進而誘導細胞凋亡的機制尚不明確。本研究結果顯示，過表達ARHI后，Wnt信號通路中經典蛋白β-catenin蛋白表達下調，且GSK-3β蛋白表達上調，說明Wnt信號通路在ARHI誘導細胞凋亡時被調控。這一結果與Li等[21]的報道相一致：LRP6通過Wnt/β-catenin途徑調節Rab7介導的自噬調節滋養層細胞的遷移和侵襲。以上結果表明，ARHI通過調控Wnt信號通路，進而影響細胞自噬，參與過表達ARHI后OSCC細胞凋亡。本研究雖然證明了Wnt信號通路參與了ARHI誘導OSCC細胞凋亡，然而，其作用機制尚不明確，有待開展后續研究。

綜上，本研究表明，ARHI可能作為口腔鱗癌細胞的抑癌基因，通過調控Wnt信號通路相關蛋白，進而加速細胞自噬，誘導細胞凋亡。而過表達ARHI基因抑制了細胞的增殖活性，并提高了誘導細胞凋亡的能力。在未來的研究中，我們將著重研究ARHI在OSCC侵襲遷移以及動物模型中的作用，為ARHI在OSCC中的作用提供更多的實驗數據支持。