黃芪甲苷對(duì)阿霉素腎病小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

于曉霞，鄭明楠，樸明姬，朱 虹，邊 艷，韓 帥，吳 華，高弼虎

0 引言

腎病綜合征是臨床上常見(jiàn)的腎臟疾病，常表現(xiàn)為低蛋白血癥、高脂血癥、大量蛋白尿等[1]，若未及時(shí)治療或治療不當(dāng)，病情可進(jìn)展為重度水腫、感染、血栓形成、急性腎損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥，對(duì)患者正常生活及自身健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，嚴(yán)重者會(huì)逐漸進(jìn)展至終末期腎病[2]。因此，尋求有效的治療措施已成為臨床醫(yī)師關(guān)注的熱點(diǎn)。

腎病綜合征的共同特點(diǎn)是足細(xì)胞損傷，目前體內(nèi)及體外多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中藥黃芪甲苷(Astragaloside IV，AS-IV)具有減輕足細(xì)胞損傷的作用[3-4]。因此，本研究通過(guò)球后靜脈注射阿霉素(Adriamycin，ADR)的方法，建立經(jīng)典的腎病綜合征動(dòng)物模型-阿霉素腎病(Adriamycin nephropathy，AN)小鼠模型[5]，并將中藥黃芪甲苷作用于阿霉素腎病小鼠，觀察其對(duì)小鼠尿蛋白、腎功能等生化指標(biāo)的影響，并通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)腎組織足細(xì)胞Nephrin、Desmin蛋白的表達(dá)，初步觀察黃芪甲苷對(duì)阿霉素腎病小鼠的保護(hù)作用，并探討可能的機(jī)制，為臨床治療腎病綜合征提供新的理論基礎(chǔ)和治療策略。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 健康無(wú)特定病原體(SPF)雄性BALB/c小鼠24只，體重(22.73±1.49)g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001。在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(遼)2018-0005。小鼠采用抽簽法隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(8只)、模型組(8只)和黃芪甲苷組(8只)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物自由攝食和飲水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均依據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》的要求，按照動(dòng)物福利與倫理原則處理。

1.2 藥物及試劑 阿霉素注射粉劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：D8740。異氟烷購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：B2028066。戊巴比妥鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：P3761。尿白蛋白/肌酐(Albumin to creatinine，ACR)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成有限公司，批號(hào)：20190722。牛血清白蛋白購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SA8130。兔抗小鼠Nephrin抗體(1∶1 000)購(gòu)自Servicebio，批號(hào)：GB11081。兔抗小鼠Desmin抗體(1∶1 000)購(gòu)自Servicebio，批號(hào)：GB11343。HRP山羊抗兔二抗(1∶200)購(gòu)自Servicebio，批號(hào)：GB23302。DAB顯色液購(gòu)自Servicebio，批號(hào)：G1211。

1.3 儀器 全自動(dòng)生化分析儀：日本Olympus公司 AUA640；光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司 CX41；低溫離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司(8K)；脫水機(jī)：武漢俊杰電子有限公司(JJ-12J)；包埋機(jī)：武漢俊杰電子有限公司(JB-P5)；病理切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司(RM2016)。

1.4 模型制備及給藥 模型組：小鼠異氟烷吸入麻醉后，經(jīng)眼球后靜脈注射阿霉素(10 mg/kg)建立實(shí)驗(yàn)阿霉素腎病小鼠模型。造模后第1周測(cè)量小鼠ACR，如模型組與對(duì)照組相比，ACR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)為造模成功。對(duì)照組：眼球后靜脈注射與阿霉素同等劑量的生理鹽水(10 ml/kg)。黃芪甲苷組：造模同模型組，造模后第2周開(kāi)始，每日給予黃芪甲苷40 mg/(kg>·d)[3](用1%羧甲基纖維素鈉溶解)灌胃，共治療8周，對(duì)照組及模型組均給予含1%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水灌胃。

1.5 小鼠尿白蛋白/肌酐檢測(cè) 分別于小鼠造模前1 d(0周)及實(shí)驗(yàn)第1周、第10周末收集尿液，低速低溫離心機(jī)中離心，去除沉渣，按試劑盒檢測(cè)說(shuō)明，采用ELISA法測(cè)定小鼠尿白蛋白和肌酐，計(jì)算ACR。

1.6 生化指標(biāo)檢測(cè)及方法 10周末，用3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后心臟穿刺采血，血液標(biāo)本置于含抗凝劑EDTA的離心管中，離心取上清置于-20 ℃冰箱保存，使用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清總蛋白(Total protein，TP)、白蛋白(Albumin，ALB)、肌酐(Serum creatinine，Scr)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、三酰甘油(Triglyceride，TG)的測(cè)定。

1.7 足細(xì)胞Nephrin、Desmin蛋白的檢測(cè) 免疫組化法檢測(cè)足細(xì)胞Nephrin、Desmin蛋白的表達(dá)：首先對(duì)所有切片進(jìn)行脫蠟處理，切片經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)后，PBS 清洗 3 min，共3次；在切片的組織上滴加 3% H2O2，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫避光放置 10 min；結(jié)束后 PBS 清洗3 min，共3次；按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋一抗，滴加適量一抗稀釋液后，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日，PBS清洗3 min，共3次，按抗體說(shuō)明書(shū)滴加二抗，室溫孵育30 min；PBS 清洗3 min，共2次，DAB 顯色30 s后，蒸餾水終止反應(yīng)。然后進(jìn)行蘇木素襯染、鹽酸酒精分化、氨水返藍(lán)，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判讀：蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色。每張片子隨機(jī)選取10個(gè)腎小球，進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的生存情況 小鼠于注射阿霉素1 d后，出現(xiàn)畏光、精神不振、毛質(zhì)粗糙及脫毛、活動(dòng)量減少、進(jìn)食及飲水量下降，有不同程度的腹瀉，1周后上述情況逐漸恢復(fù)。模型組小鼠于造模后第2天死亡1只；黃芪甲苷組小鼠于造模后第3周死亡1只。其余小鼠均健康存活。

2.2 各組小鼠體重比較 模型組及黃芪甲苷組小鼠注射阿霉素后，平均體重迅速下降，至第1周末降至最低，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第2周開(kāi)始兩組小鼠體重均逐漸增長(zhǎng)，但模型組小鼠于第2、4、6周末測(cè)量體重仍明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，黃芪甲苷組小鼠體重增長(zhǎng)速度略快，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 黃芪甲苷對(duì)阿霉素腎病小鼠ACR的影響 各組小鼠造模前ACR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，造模后第1周末，模型組及黃芪甲苷組小鼠ACR較對(duì)照組明顯升高(P<0.001)，提示造模成功。實(shí)驗(yàn)第10周末，與對(duì)照組相比，模型組小鼠ACR顯著增加(P<0.01)；黃芪甲苷治療后，小鼠ACR水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠ACR比較注：*與對(duì)照組比較，P<0.001；#與模型組比較，P<0.001

2.4 黃芪甲苷對(duì)阿霉素腎病小鼠生化指標(biāo)的影響 實(shí)驗(yàn)第10周末，與對(duì)照組比較，模型組小鼠TP、ALB明顯降低，TC、TG、BUN及Scr均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷治療組ALB水平顯著升高(P<0.01)，TC、TG、BUN及Scr均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠生化指標(biāo)比較結(jié)果注：*與對(duì)照組比較，P<0.01；#與模型組比較，P<0.05；##與模型組比較，P<0.01

2.5 黃芪甲苷對(duì)小鼠足細(xì)胞Nephrin、Desmin蛋白的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎臟組織足細(xì)胞Nephrin的表達(dá)明顯減少，Desmin蛋白的表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)黃芪甲苷治療后，Nephrin的表達(dá)較模型組顯著上調(diào)，Desmin蛋白的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 各組小鼠足細(xì)胞Nephrin、Desmin蛋白的表達(dá)情況(400×)注：紅色箭頭為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞

圖5 各組小鼠足細(xì)胞Nephrin、Desmin蛋白的表達(dá)情況注：*與對(duì)照組比較，P<0.01；#與模型組比較，P<0.05

3 討論

腎病綜合征發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是一種常見(jiàn)的難以根治的腎臟疾病，其主要發(fā)病機(jī)制是腎小球基底膜通透性增加，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)率降低，表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和水腫[6]。本研究采用眼球后靜脈叢注射阿霉素的方法復(fù)制阿霉素腎病模型以模擬人類腎病綜合征，結(jié)果顯示，小鼠尿蛋白、血肌酐及血脂水平顯著升高，血清白蛋白降低，證實(shí)成功建立了小鼠腎病綜合征模型。文獻(xiàn)報(bào)道，嚙齒類動(dòng)物注射阿霉素后，藥物能迅速分布于腎臟組織引起腎損害[7]，主要機(jī)制：①阿霉素對(duì)足細(xì)胞有直接毒性作用，可導(dǎo)致足細(xì)胞相關(guān)蛋白分布以及細(xì)胞骨架發(fā)生紊亂，造成足細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；②阿霉素含有醌式結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生活性氧，誘發(fā)腎小球上皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞腎小球?yàn)V過(guò)膜的完整性，導(dǎo)致膜濾過(guò)屏障病變而形成持續(xù)蛋白尿；③阿霉素能激活多種細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)，破壞腎臟固有細(xì)胞，促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖和系膜基質(zhì)增多，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，緩慢發(fā)展形成腎小球硬化[8-11]。

蛋白尿是促進(jìn)慢性腎臟病向終末期腎臟病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此，控制蛋白尿是防治腎臟病進(jìn)展的基礎(chǔ)。我國(guó)的傳統(tǒng)中藥黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、行水消腫和脫毒生肌等功效，自古廣泛應(yīng)用于腎臟病的治療。孫成峰[12]對(duì)96例原發(fā)性腎病綜合征患者進(jìn)行觀察，對(duì)照組患者口服強(qiáng)的松，觀察組患者在口服同等劑量強(qiáng)的松的基礎(chǔ)上聯(lián)合黃芪注射液，連續(xù)治療1個(gè)月后，兩組患者的24 h尿蛋白定量均明顯降低，血漿白蛋白明顯增多，并且觀察組患者上述各項(xiàng)指標(biāo)改善效果均顯著優(yōu)于對(duì)照組。Zhang等[13]通過(guò)Meta分析研究了黃芪單體或其提取物對(duì)慢性腎臟病患者的治療作用，發(fā)現(xiàn)黃芪能夠有效降低患者肌酐清除率，提高血清白蛋白水平。上述結(jié)果提示，黃芪可明顯改善原發(fā)性腎病綜合征及慢性腎臟病患者的尿蛋白、血漿白蛋白等指標(biāo)水平，具有腎臟保護(hù)作用。黃芪甲苷是黃芪最主要的藥理活性成分之一，本研究中，給予阿霉素腎病小鼠黃芪甲苷治療后，與模型組小鼠比較，治療組小鼠的尿蛋白、血肌酐水平均顯著降低，且血白蛋白水平顯著升高，提示黃芪甲苷可有效降低阿霉素腎病小鼠的尿蛋白及血肌酐水平，升高血清白蛋白，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

腎病綜合征患者伴有嚴(yán)重的血脂代謝異常，常表現(xiàn)為膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平升高等，而高脂血癥也是腎小球硬化發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立致病因素，對(duì)腎病綜合征的進(jìn)展有重要的影響，降脂治療也具有改善蛋白尿的作用[14]。余伍中等[15]發(fā)現(xiàn)，黃芪能夠通過(guò)增強(qiáng)脂蛋白酯酶與卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性，促進(jìn)低密度脂蛋白的降解和膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低血三酰甘油和膽固醇水平，上調(diào)低密度脂蛋白受體mRNA表達(dá)，促進(jìn)三酰甘油、膽固醇降解而從循環(huán)中清除。本研究觀察到黃芪甲苷可顯著降低阿霉素腎病小鼠的三酰甘油及膽固醇水平，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。說(shuō)明黃芪甲苷可通過(guò)降低阿霉素腎病小鼠的血脂水平發(fā)揮腎保護(hù)作用。

大量研究證實(shí)，蛋白尿的產(chǎn)生與腎臟足細(xì)胞的損傷密切相關(guān)。近年來(lái)，研究者先后確定了多個(gè)定位于足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白分子，如Nephrin、Desmin等，且均與蛋白尿的產(chǎn)生密切相關(guān)。在很多腎臟疾病中，足細(xì)胞上Nephrin和Desmin的表達(dá)失調(diào)早于足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變和蛋白尿的發(fā)生[16]。研究認(rèn)為，Nephrin表達(dá)下調(diào)和Desmin表達(dá)上調(diào)是足細(xì)胞損傷的標(biāo)志[17-18]。在本研究中，模型組小鼠足細(xì)胞Nephrin表達(dá)明顯下降，Desmin表達(dá)量升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；給予黃芪甲苷治療可顯著上調(diào)足細(xì)胞Nephrin表達(dá)，下調(diào)Desmin表達(dá)。證實(shí)黃芪甲苷可調(diào)控足細(xì)胞Nephrin和Desmin表達(dá),從而減輕足細(xì)胞損傷，保護(hù)腎臟。

綜上所述，黃芪甲苷可通過(guò)調(diào)節(jié)足細(xì)胞Nephrin和Desmin蛋白的表達(dá)，降低阿霉素腎病小鼠尿蛋白、血肌酐及血脂水平，提高血白蛋白水平，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。