胰腺癌靶向的碳納米管超聲造影劑的制備及體內外評價

胡楚玲，顧芬芬，臺宗光，高 申，張敏敏

0 引言

胰腺癌起病隱匿，診斷和治療困難，且預后極差。早期根治性切除是胰腺癌最有效的治療方法，但切除率僅為10%～20%，五年生存率僅為0.4%～3.4%[1-2]。因此，早期診斷和早期治療是改善胰腺癌預后的關鍵[3]。

超聲造影增強技術是近年來發展起來的，與CT、MRI等其他影像學方法相比，具有價格低、安全性高、操作簡便、實時觀察等優點[4-5]。主要通過靜脈注射微泡造影劑，利用界面回聲阻抗差，將腫瘤從周圍組織凸顯出來，在胰腺癌診斷中的敏感性高達94%，已成為診斷胰腺疾病的主要方法[6-8]。但是，這種微泡仍然存在許多問題，例如對病變的部位無親和力。微泡的直徑較大(2～6 μm)，無法穿透血管壁到達靶細胞[9]。此外，由于半衰期短，有效維持時間只能持續數十秒或幾分鐘[10]。因此，尋找一種新型、理想、高效、體積小、穿透力強的新型理想靶向造影劑是腫瘤靶向成像領域最重要的研究方向。

多壁碳納米管(Multi-wall carbon nanotubes，MWCNT)具有高吸附性及光和高回聲的特征，可以將成像技術和藥物輸送結合起來用于疾病的診斷[11]。同時碳納米管可以穿過許多生物屏障，可用于納米醫學領域，例如診斷、疾病治療、生物成像和組織工程[12-13]。碳納米管具有許多獨特的特性，但由于其不溶于水和大多數有機溶劑，從而阻礙了其在生物醫學領域的應用。因此，非常有必要進行碳納米管的功能修飾，以改善生物相容性和分散性。

Hedgehog信號通路是胰腺癌形成中的重要信號通路。2003年《自然》雜志報道了Hedgehog蛋白在胰腺癌細胞中高表達[14-15]。Hedgehog與腫瘤細胞的生長密切相關，幾乎所有胰腺癌中都高表達Hedgehog，并且在早期腫瘤中就出現了高表達狀態，而正常成年人的Hedgehog蛋白幾乎不表達[16-17]。Hedgehog蛋白的表達隨疾病的進展而增加[18]。這些結果表明，Hedgehog對于胰腺癌的早期診斷非常重要，Hedgehog蛋白可以作為胰腺癌分子成像的理想標記[19-20]。基于以上認識，本研究構建一種Hedgehog單克隆抗體修飾的超聲造影劑，用于CE-EUS以實現胰腺癌的特異性靶向。

在本研究中，將聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG2000)共價修飾到活化的碳納米管表面，然后與Hedgehog單克隆抗體(mAb-Hedgehog)結合。形成的受體特異性靶向的MWCNT-PEG-HH納米遞送系統用于US成像和藥物遞送。制備的MWCNT-PEG-HH納米靶向造影劑，與普通微泡造影劑相比，具有高分辨率、半衰期長、良好的滲透性、安全性和穩定性的特性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Zeta sizer ZS90電位粒徑分析儀(英國Malvern公司)；透射電鏡(JEM-2010，日本JEOL公司)；傅里葉紅外儀(美國Thermo公司)；熒光顯微鏡(德國Leica公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；多壁碳納米管(美國Brattleboro 公司)；雙功能聚乙二醇(NH2-PEG-COOH，平均分子量2 000，嘉興博美生物技術有限公司)；Hedgehog單克隆抗體(英國Abcam公司)；DMEM培養液、胎牛血清FBS(美國Gibco公司)，其他試劑均為分析純。胰腺癌細胞株SW1990購自美國ATCC公司。BALB/c裸鼠(雄性，4周齡)，購于中科院上海實驗動物中心，第二軍醫大學實驗動物中心SPF潔凈室精心飼養。實驗按照第二軍醫大學實驗動物倫理委員會規定開展。

1.2 MWCNT-PEG-HH的合成

1.2.1 MWCNTs的氧化 將2 g多壁碳納米管與體積比1∶3的濃硫酸∶濃硝酸混合(80 ml)。混合液在40 ℃ 40 kHz超聲條件下超聲7 h，繼續攪拌24 h。將反應后的多壁碳納米管離心，凍干，備用。

1.2.2 MWCNTs-PEG-2000合成 將60 mg MWCNT-COOH溶于200 ml甲醇中，分別加入EDC和NHS 0.6 g和0.4 g，以活化羧基，混合物在室溫下攪拌3 h。所得產物氮氣吹干，洗滌，凍干。將10 mg PEG-2000與活化的MWCNT-COOH 20 mg共同溶解于甲醇中，繼續攪拌24 h。所得產物氮氣吹干，洗滌，離心，凍干。合成的聚合物用紅外光譜(FT-IR)進行檢測。

1.2.3 MWCNT-PEG-HH的合成 將0.3 g EDC 和0.2 g NHS加入到20 mg MWCNT-PEG-COOH磷酸鹽緩沖液中，繼續攪拌3 h，加入50 μl Hedgehog mAb (HH)，室溫下避光攪拌24 h，洗滌，離心，凍干，得到MWCNT-PEG-HH(圖1)。合成的MWCNT-PEG-HH用紅外光譜(FT-IR)進行檢測。將hedgehog mAb用FITC標記，其在波長490～495 nm處有紫外吸收，故通過紫外光譜儀對合成的MWCNT-PEG-HH進行檢測。

圖1 MWCNT-PEG-HH合成示意圖

1.3 MWCNT-PEG-HH超聲納米造影劑的形態觀察和電位測定 將適量的MWCNT-PEG-HH溶液滴于覆蓋有碳膜的銅網上，用濾紙吸干剩余溶液，干燥后，利用透射電鏡觀察形態。另取MWCNT-PEG-HH溶液20 μl，加入PBS溶液中，利用粒徑分析儀測定MWCNT-PEG-HH的電位，測定條件為25 ℃、固定角90°。

1.4 MWCNT-PEG-HH超聲納米造影劑的體外細胞學評價

1.4.1 流式細胞術考察細胞攝取能力 采用流式細胞術考察超聲碳納米管(MWCNT-PEG-HH)造影劑在人胰腺癌細胞SW1990的攝取能力。將處于對數生長期的SW1990細胞按2×105個/孔接種到12孔板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養24 h。培養24 h后更換為無血清培養基，之后每孔加入Cy5標記的MWCNT-PEG-HH(碳納米管濃度：10、100、200 μg/ml)，培養板放入孵箱中繼續培養4 h。細胞利用PBS潤洗3次，胰酶消化，離心后PBS重懸。利用流式細胞儀檢測細胞對納米復合物的攝取情況。

1.4.2 共聚焦顯微鏡考察細胞內分布情況 采用共聚焦顯微鏡考察超聲碳納米管(MWCNT-PEG-HH)造影劑在人胰腺癌細胞SW1990的細胞內分布情況。將處于對數生長期的SW1990細胞按5×104個/孔接種到覆蓋有圓形玻璃片的24孔板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養24 h。培養24 h后更換為無血清培養基，之后每孔加入Cy5標記的MWCNT-PEG-HH(碳納米管：10、100、200 μg/ml)，培養板放入孵箱中繼續培養4 h。吸掉培養基，每孔加入500 μl 4%的多聚甲醛溶液，置于4 ℃冰箱中固定1 h，PBS潤洗3次，將每孔中的圓形玻璃片取出，吸取1滴封片液(含DAPI)滴到載玻片上，將圓形玻片細胞生長面朝下蓋于載玻片上。利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞對碳納米管的攝取及胞內分布情況，并拍照記錄。

1.4.3 CCK-8法考察超聲碳納米管細胞毒性 采用CCK-8法對碳納米管超聲造影劑(MWCNT-PEG-HH)的細胞毒性進行考察。將處于對數生長期的人胰腺癌細胞SW1990按8×103個/孔接種到覆蓋有圓形玻璃片的96孔板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養24 h。培養24 h后更換為無血清培養基，之后每孔加入不同溶度的碳納米管超聲造影劑，繼續培養24 h、48 h，吸掉培養基，PBS潤洗3次，每孔加入含CCK-8的新鮮培養基，繼續1 h，振蕩30 s后，酶標儀450 nm測定OD值，以未處理細胞為對照，未接種細胞的孔為空白孔，計算各孔的細胞活力。

1.5 考察碳納米管超聲造影劑體外顯影情況 采用超聲造影儀(Mylab 90 scanner)考察碳納米管的體外造影能力。將不同濃度MWCNT及MWCNT-PEG-HH加入2 ml EP管中，以PBS為對照。在6.0 MHz超聲頻率下，用耦合劑涂覆于超聲探頭表面，在純化水介質中考察碳納米管的體外顯影情況。

1.6 考察碳納米管超聲造影劑體內顯影情況

1.6.1 人胰腺癌裸鼠移植瘤模型的構建 將處于對數生長期的SW1990細胞利用胰酶消化，離心后用4%培養基重懸至1×108個/ml的細胞懸液，加入相等體積的基質膠溶液，在冰浴中吹打均勻。選取4周齡的BALB/c裸鼠(16～17 g)，用1 ml注射器將100 μl細胞接種液接種到裸鼠右上肢背部皮下，繼續飼養2周后，選取18只腫瘤直徑10 mm的裸鼠，作為動物模型用于下一步研究。

1.6.2 考察碳納米管超聲造影劑的體內顯影 將構建的移植瘤裸鼠隨機分為3組，每組6只。按照Wu等[21]多壁碳納米管偶聯前列腺干細胞的抗原抗體用于靶向超聲增強與藥物遞送中的給藥劑量，經尾靜脈分別注射10 mg/kg (200 μl溶液)的MWCNT-PEG、MWCNT-PEG-HH，并以PBS為對照。注射后1 h、8 h、24 h，用超聲造影儀考察碳納米管在腫瘤、心臟、腎臟的顯影情況。

2 結果

2.1 合成材料的紅外、紫外光譜圖 通過傅里葉變換紅外光譜對合成產物進行分析，結果顯示(圖2A)，MWCNT-COOH在1 704 cm-1出現了吸收峰，這主要歸因于羧基上的羰基。當用PEG-2000共價修飾后，新的吸收帶出現在2 928 cm-1和2 854 cm-1處，這屬于-CH2對稱拉伸振動。959 cm-1處的吸收峰歸因于-C-O-C面內形變振動，而1 410 cm-1處的吸收峰屬于-CH2的彎曲振動。此外，從圖中可以看出，1 704 cm-1處的吸收帶強度顯著降低，表明MWCNT-COOH裸露的COOH基團通過共價鍵成功地與PEG2000結合。紫外光譜顯示(圖2B)，MWCNT-PEG-HH在波長490～495 nm處有紫外吸收，表明Hedgehog抗體連接成功。

圖2 MWCNT-PEG-HH的表征注：A.MWCNT-PEG-HH、MWCNT-PEG紅外光譜圖；B.MWCNT-PEG-HH、MWCNT-PEG紫外可見光譜圖

2.2 多壁碳納米管超聲造影劑的形態、電位 將制備的碳納米管造影劑于透射電子顯微鏡下觀察，多壁碳納米管具有良好的分散性，長度在400 nm左右(圖3A)。電位粒徑分析儀測得碳納米管造影劑的電位為(-38.9±4.28) mV(圖3B)。

圖3 MWCNT-PEG-HH的表征注：A.MWCNT-PEG-HH的Zeta電位；B.MWCNT-PEG-HH的透射電鏡圖

2.3 多壁碳納米管超聲造影劑的體外攝取能力評價 通過流式細胞術觀察胰腺癌細胞對靶向納米造影劑的攝取情況。如圖4A和4B所示，MWCNT-PEG-HH的攝取呈濃度依賴性，當濃度為100 μg/ml時，陽性Cy3細胞接近100%，平均熒光強度為578。說明人胰腺癌細胞可以高效攝取載Hedgehog抗體的多壁碳納米管超聲造影劑。

利用激光共聚焦顯微鏡觀察多壁碳納米管超聲造影劑在人胰腺癌細胞內的分布情況。圖4C中藍色表示DAPI深染的細胞核，紅色表示的是細胞內分布的Cy5熒光染料。從圖中可以看出，MWCNT-PEG-HH組紅色熒光出現在藍色的細胞核周圍，較Cy5組熒光強，說明Cy5被成功遞送到SW1990細胞內。

圖4 MWCNT-PEG-HH的細胞攝取情況注：A.流式細胞數據(MWCNT-PEG-HH濃度分別為10、100、200 μg/ml)；B.平均熒光強度和百分比；C.激光共聚焦顯微鏡觀察MWCNT-PEG-HH在細胞內的分布情況(a.Cy5；b.MWCNT-PEG-HH-Cy5)

2.4 多壁碳納米管超聲造影劑的細胞毒性 我們采用CCK-8考察多壁碳納米管超聲造影劑的細胞毒性。從圖5可以看出，處理24 h、48 h后，多壁碳納米管超聲造影劑對SW1990細胞未見明顯毒性。只有當碳納米管濃度達到300 μg/ml時，SW1990細胞活力在處理后48 h約降至80%，說明多壁碳納米管本身毒性較低。

圖5 CCK-8法考察不同濃度條件下MWCNT-PEG-HH對SW1990細胞的細胞毒性(n=3)

2.5 考察碳納米管超聲造影劑體外顯影情況 采用超聲造影儀考察碳納米管的體外造影能力。從圖6可以看出，PBS溶液在體外基本無顯影。而碳納米管溶液在10 μg/ml時，即出現顯影，當濃度達到200 μg/ml時，可以看到顯影非常明顯，且MWCNT-PEG-HH和MWCNT-PEG無顯著差別。說明多壁碳納米管超聲造影劑在體外具有較好的顯影效果。

圖6 MWCNT-PEG-HH、MWCNT-PEG-HH在不同濃度條件下體外顯影圖注：A.MWCNT-PEG；B.MWCNT-PEG-HH

2.6 考察碳納米管超聲造影劑的體內顯影 給藥前，分別用超聲造影儀記錄各組腫瘤、腎臟和心臟的顯影成像并記錄。如圖7所示，與未治療的小鼠相比，經尾靜脈注射MWCNT-PEG-HH 8 h后，可以明顯觀察到超聲造影劑在腫瘤部位的增強作用，表明碳納米管超聲造影劑在體內具有較高的超聲增強作用。與MWCNT-PEG-HH高US信號增強相反，MWCNT-PEG處理組的US成像僅觀察到輕微的增強。此外，腫瘤部位成像顯示峰谷效應。隨著注入時間的增加，增強作用先增加，然后逐漸變弱，并且增強作用可以維持很長時間，這可以為碳納米管的診斷和治療提供整合條件。

同時，我們研究了碳納米管在腎臟和心臟中的分布，以評估體內的分布和代謝。如圖7所示，腎臟在1 h時可出現輕微的US信號增強，而在8 h時可出現較高的US信號增強，然后減弱，表明碳納米管具有腎臟代謝的特征。但是，在心臟中，各時間點，無論是二維模型還是CF模式，都沒有增強信號，表明碳納米管不會在心臟中積聚并產生毒性。

圖7 MWCNT-PEG-HH體內顯影圖注：A.MWCNT-PEG在腫瘤組織中的顯影；B.MWCNT-PEG-HH在腫瘤組織中的顯影；C.MWCNT-PEG-HH在腎臟中的顯影；D.2D及CF模式下MWCNT-PEG-HH在心臟中的顯影

3 討論

在本研究中，我們通過酰胺化反應合成了MWCNT-PEG-HH聚合物。在合成過程中，使用H2SO4和HNO3氧化MWCNT。細胞攝取結果表明，MWCNT-PEG-HH的細胞攝取效率明顯高于MWCNT-PEG，這可能是由于抗體的修飾所致。細胞毒性研究表明，MWCNT-PEG-HH和MWCNT-PEG具有高度的生物相容性。這可能是由于碳納米管的化學修飾增加了水溶性和生物相容性。本研究設計了用于腫瘤靶向成像的多壁碳納米管。PEG修飾可以增加水溶性和多壁碳納米管的穩定性[22]。Hedgehog單克隆抗體被用作胰腺癌的特定靶標。制備的MWCNT-PEG-HH具有良好的生物相容性，抗體的結合增強了細胞的攝取能力。在體外和體內研究中，制備的納米靶標造影劑具有巨大的潛力，可以作為靶向CE-EUS造影劑。

綜上所述，本研究選用PEG修飾多壁碳納米管得到納米級超聲造影劑，在表面連接Hedgehog單克隆抗體以實現胰腺癌的靶向性，體內外評價表明其具有成為胰腺癌靶向的新型造影劑的潛力，后期我們將進一步包裹難溶性化療藥物以實現診斷與治療的雙重目的。