牛源性大腸桿菌O26熱休克-酸應激響應

宓曉雨，張 蘇，王思亓，趙王晨，禹金龍，林思棋，王龍鳳，江 蕓

（南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210023）

大腸桿菌O157:H7是重要的食源性致病菌，然而近年來非O157大腸桿菌，尤其是“Big six”血清型（O26、O45、O103、O121、O111、O145）所引發的食品安全事件越來越受到國內外廣泛關注，其中O26是威脅人類健康的最重要的非O157大腸桿菌，居“Big six”之首[1-3]。反芻動物，尤其是牛，是致病大腸桿菌的主要宿主。本課題組前期從牛糞、牛肉中對非O157大腸桿菌進行了分離鑒定，也發現O26是最主要的血清型[4]。與大腸桿菌O157:H7相似，O26也可導致人體腹瀉，以及出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥等嚴重并發癥[1,5]。

食品加工貯藏過程中各種措施可對腐敗菌和致病菌產生應激脅迫，導致有害菌損傷或死亡，有效延長貨架期。一般認為多種措施聯合應用時，可發揮柵欄效應，增強抑菌效果[6-7]。然而，有研究發現，細菌在多重應激條件下有可能產生交叉保護現象，增強有害菌的抗性，從而提高存活能力，加大食品安全的風險[8-9]。酸化是食品加工中常見措施，其中酸性洗液或發酵食品中存在的乳酸可有效抑制有害菌的生長繁殖。加熱也是食品工業中廣泛應用的技術之一。早期有研究發現，熱休克處理可增強大腸桿菌O157:H7的耐酸能力，提高存活率[10-11]。目前，熱休克-酸應激對非O157大腸桿菌的存活，尤其是對應激相關基因表達的影響鮮有報道。因此，本實驗以前期分離的牛源性大腸桿菌O26為研究對象[4]，首先比較22 株牛源性O26酸耐受能力，再選取代表菌株研究熱休克-酸應激對其存活及應激相關基因表達的影響。旨在為非O157大腸桿菌的食品安全風險評估提供理論基礎，為實際生產加工中非O157大腸桿菌的有效控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

22 株大腸桿菌O26，由本實驗室前期分離自牛糞和牛肉，其中攜帶毒力基因的有3 株，包括G13Z1（stx1+、hly+）、G10Z1（hly+）、133Z（hly+）。

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、酵母浸粉（yeast extract，YE） 北京陸橋公司；乳酸、鹽酸、pH值校正緩沖溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 南京化學試劑有限公司；細菌RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒 大連寶生物工程有限公司；實驗用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

IS128C pH計 上海儀邁儀器科技有限公司；HH-S2數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療器械廠；SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養箱 上海一恒科技公司；SG403A生物安全柜 美國Baker公司；7500 real-time PCR儀美國Applied Biosystems公司；Nanodrop-2000核酸蛋白分析儀 美國Thermo公司；2-16KL高速冷凍離心機美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養

將22 株O26凍存菌液分別經TSA劃線培養，37 ℃培養24 h，挑取單菌落分別接種于3 mL TSB中，220 r/min、37 ℃ 振蕩培養18 h，再轉接至100 mL TSB中，220 r/min、37 ℃振蕩培養18 h，約至9（lg（CFU/mL））。

1.3.2 酸耐受實驗

吸取1.3.1節菌液10 mL，8 000×g、4 ℃離心10 min，沉淀用PBS（pH 7.2）洗滌2 次，分別重懸于等體積的鹽酸酸化TSB（pH 2.0）、乳酸酸化TSB（pH 3.5）中，37 ℃應激處理2 h，離心，沉淀用PBS洗滌重懸終止應激反應。TSA-YE平板37 ℃培養24 h計數。進一步計算應激后相對于應激前菌數的存活率。

1.3.3 熱休克-酸應激實驗

根據乳酸耐受情況，選取代表菌株混合菌液進行熱休克-酸應激存活實驗，進一步根據存活情況，選取代表菌株進行應激基因表達分析。

1.3.3.1 應激處理

熱休克處理：將1.3.1節代表菌株的菌液等量混合，吸取10 mL，8 000×g、4 ℃離心10 min，沉淀用PBS（pH 7.2）洗滌2 次，重懸于10 mL TSB中，48 ℃水浴15 min，冰水浴3 min終止[12-14]。

分別取熱休克菌液和未熱休克菌液0.1 mL接種于乳酸酸化的9.9 mL TSB（pH 3.5），37 ℃應激處理2、4、6、8 h，前者為熱休克-酸應激組，后者為酸應激組。同時未熱休克菌液0.1 mL接種于9.9 mL正常TSB作為對照組。TSA-YE培養計數。

1.3.3.2 應激基因表達分析

應激處理2、4 h樣品，離心、PBS洗滌重懸、再離心，菌體沉淀按試劑盒說明書提取總RNA，進一步檢測總RNA的濃度和純度，當A260nm/A280nm在1.8～2.0時表明純度較好。

cDNA合成：首先用RNase-free DNase I去除基因組DNA以保證反轉錄效應。采用反轉錄試劑盒，反轉錄體系為20 μL，其中PrimeScrept RT Master Mix 6 μL，total RNA終質量濃度50 ng/μL，RNase Free dH2O補足體積。反轉錄條件為：37 ℃反轉錄反應15 min；85 ℃反轉錄失活反應5 s；4 ℃，∞。cDNA于-20 ℃凍存。

real-time PCR：引物序列如表1所示[15-19]，用于擴增大腸桿菌O26的一般應激基因rpoS、酸應激相關基因（asr、ycfR、gadA）及熱應激相關基因（rpoH、dnaK、clpB、groEL），內參基因為rrsA[15]。PCR擴增體系（20 μL）為SYBR Premix ExTaq（2×）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，上下游引物各0.4 μL，RNase Free水補足。PCR程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s（40 個循環）；60～95 ℃，熔點分析。

表1 應激相關基因real-time PCR引物Table 1 Real-time PCR primer sequences for stress response genes

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌O26菌株酸耐受比較

鹽酸耐受實驗發現，鹽酸處理2 h后22 株菌存活菌數均顯著下降（P＜0.05），但耐受情況存在菌株差異，其中菌株133Z（hly+）存活率最高（92.92%），而菌株G13Z1（stx1+、hly+）下降最明顯，存活率為57.98%（圖1A）。乳酸耐受實驗發現，乳酸處理2 h后22 株菌存活菌數均顯著下降（P＜0.05），耐受情況亦存在菌株差異，菌株43SZ、77Z2、1Z2、G13Z1（stx1+、hly+）乳酸耐受較強，存活率達84%以上，其中菌株43SZ存活率最高（91.08%）；菌株G10Z1（hly+）（65.46%）、83Z2（63.43%）、83Z3（62.54%）存活率較低（圖1B）。

圖1 22 株大腸桿菌O26鹽酸（A）和乳酸（B）耐受結果Fig.1 Hydrochloric acid (A) and lactic acid (B) tolerance of 22 E.coli O26 isolates

綜合兩種酸的耐受情況，22 株菌對鹽酸和乳酸的耐受存在不同，菌株43SZ、123Z1對鹽酸和乳酸均較耐受，G13Z1（stx1+、hly+）不耐鹽酸，對乳酸則有較高耐受能力，而G10Z1（hly+）不耐乳酸，對鹽酸則有較高耐受能力。另外，實驗發現3 株毒力基因陽性的O26菌株G13Z1（stx1+、hly+）、G10Z1（hly+）、133Z（hly+）并沒有呈現出很強的耐受能力。

2.2 熱休克-酸應激對大腸桿菌O26存活的影響

根據酸耐受情況，選取以下5 株菌進行熱休克-乳酸應激：43SZ（鹽酸和乳酸耐受力均較強）、G13Z1（鹽酸耐受力最弱、乳酸耐受力較強）、49Z3（鹽酸耐受力較弱、乳酸耐受力中等）、G10Z1（鹽酸耐受力較強、乳酸耐受力較弱）、83Z3（鹽酸耐受力中等、乳酸耐受力較弱）。如圖2所示，混菌初始菌數約7.0（lg（CFU/mL）），在對照組中菌數逐漸增加，8 h后達到9.0（lg（CFU/mL））以上。酸應激組，應激2 h存活菌數即顯著下降（P＜0.05），隨著應激時間的延長存活菌數繼續下降，至8 h時已檢測不出。熱休克-酸應激組，應激后存活菌數亦逐漸下降，但應激4 h及以后存活菌數均顯著高于酸應激組（P＜0.05），表明熱休克處理提高了酸應激菌體的存活。

圖2 大腸桿菌O26熱休克-酸應激存活實驗結果Fig.2 Survival of E.coli O26 under heat shock-acid stress

2.3 熱休克-酸應激對大腸桿菌O26應激相關基因表達的影響

選取菌株G10Z1（hly+，分離自牛肉）進一步分析熱休克-酸應激2、4 h時其應激相關基因表達差異。rpoS基因表達情況與對照組相比，酸應激2、4 h均顯著下調（P＜0.05）、熱休克-酸應激組均顯著上調（P＜0.05）；與酸應激組相比，熱休克-酸應激組均顯著上調（P＜0.05）（圖3）。

圖3 熱休克-酸應激時大腸桿菌O26 rpoS基因表達Fig.3 Expression of rpoS in E.coli O26 under heat shock-acid stress

酸應激相關基因asr、ycfR、gadA表達情況見圖4。其中asr基因酸應激2、4 h均顯著下調，熱休克-酸應激組與酸應激組相比顯著上調（P＜0.05）。ycfR基因酸應激2 h顯著下調，4 h顯著上調，而熱休克-酸應激組2、4 h均顯著上調。gadA基因應激后均顯著下調（P＜0.05），且熱休克-酸應激組下調更明顯。

圖4 熱休克-酸應激時大腸桿菌O26酸應激相關基因表達Fig.4 Expression of acid stress response genes in E.coli O26 under heat shock-acid stress

熱應激相關基因rpoH、clpB、dnaK、groEL表達見圖5。酸應激2、4 h，4 種基因均顯著下調；熱休克-酸應激組4 種基因除clpB、groEL2 h下調，其他均顯著上調（P＜0.05）。

圖5 熱休克-酸應激時大腸桿菌O26熱應激相關基因表達Fig.5 Expression of heat stress response genes in E.coli O26 under heat shock-acid stress

綜上，與對照組相比，菌株O26酸應激2、4 h基因表達水平顯著下調（除ycfR4 h組）；與酸應激組相比，熱休克-酸應激2、4 h基因表達水平顯著上調（除gadA基因）。

3 討 論

乳酸在食品生產加工中廣泛存在，對食源性致病菌具有良好的抑制和殺滅效應[21]。由于菌株差異，其應激響應機制的不同，導致對乳酸應激呈現不同的應激存活反應。本實驗對22 株牛源性大腸桿菌O26進行耐酸性比較，發現大腸桿菌O26對乳酸耐受存在明顯菌株差異。實驗還發現同一菌株對乳酸、鹽酸的耐受性不同，這與細菌對有機酸和無機酸的應激響應機制不同有關[22-23]。

食品生產加工中柵欄技術的使用，不同柵欄因子聯合應用可發揮協同殺菌效應，顯著增強抑菌效果[6-7]；另一方面，交叉保護效應的存在[8-9]也越來越引起研究者的重視。加熱是重要的生產加工手段，可有效控制有害菌，而加熱不充分、溫熱處理也有可能提高熱休克菌體對致死性應激的耐受能力，產生交叉保護。Wiegand等[10]發現熱休克處理（48.3 ℃或49.4 ℃，5 min）提高了碎牛肉中大腸桿菌O157:H7經54.4 ℃處理后的存活菌數。熱休克處理（47 ℃，15 min）提高了阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）對低溫和冷凍、干燥、高滲透、酸、乙醇、抗感染劑等多種應激的耐受[12,24]。Tetteh等[13]發現熱休克處理（48 ℃，15 min）增強了福氏志賀菌（Shigella flexneri）對醋酸、乳酸、丙酸的耐受能力。Wang等[11]發現熱休克處理（48 ℃，10 min）增強了大腸桿菌O157:H7對鹽酸的耐受能力。本實驗發現熱休克處理（48 ℃，15 min）增強了大腸桿菌O26的乳酸耐受能力，存活菌數顯著提高，表明熱休克對酸應激菌體產生了交叉保護，這將增加食品安全風險，需引起重視。

應激過程中相關基因參與細菌的應激響應。大腸桿菌于非致死性酸性條件下可誘導多種耐酸系統和相關基因表達[25]。rpoS基因是調節一般應激反應的主要調節因子，可保護細菌免受有害環境條件的傷害[26]。Lee等[27]研究報道酸性條件（pH 4.4）誘導鼠傷寒沙門氏菌rpoS蛋白表達上調。然而，Yang Yishan等[28]研究發現腸炎沙門氏菌長期暴露于乳酸條件并未上調rpoS表達，King等[29]也發現大腸桿菌酸性pH值時rpoS水平較中性pH值低，本實驗乳酸（pH 3.0）應激后大腸桿菌O26rpoS基因表達也下調。上述報道不完全一致的原因可能與菌種、菌株、酸濃度、應激時間等有關。本實驗中熱休克-酸應激O26菌株rpoS基因表達上調，表明熱休克產生的交叉保護與rpoS基因的表達有關。

asr基因在酸應激中起關鍵作用[17]。谷氨酸依賴型耐酸系統是大腸桿菌最有效的耐酸系統，gadA、gadB、gadC是主要的關鍵基因[25]。本實驗乳酸應激后酸應激相關基因的表達基本下調，可能是該酸性條件對菌株G10Z1來說應激程度強烈，達到致死性水平。進一步熱休克處理導致上述基因表達上調，表明熱休克的交叉保護與這些酸應激基因的表達有關。Carruthers等[30]采用轉錄組學發現大腸桿菌O157:H7熱休克處理（50 ℃，15 min）導致82 個基因上調，包括rpoH、dnaK、groEL等。本實驗乳酸應激后O26的rpoH、dnaK、groEL、clpB基因表達均顯著下調，但熱休克-酸應激處理基本上調，表明熱休克的交叉保護與這些熱應激基因的表達調控有關。

4 結 論

本實驗選取牛源性O26菌株乳酸耐受性能不同的菌株混合進行熱休克-酸應激存活實驗，發現O26酸耐受程度呈現菌株差異，且同一菌株對乳酸、鹽酸的耐受情況有差異。熱休克-酸應激存活實驗發現，應激導致存活菌數顯著下降，而熱休克可發揮交叉保護效應，增強了O26抗酸能力。酸應激導致應激相關基因表達基本下調，而熱休克-酸應激與酸應激菌體相比上述基因表達基本上調，表明熱休克可能通過增加應激相關基因的表達發揮交叉保護作用。本實驗結果提示，當非致死性熱處理與酸化聯合使用時應注意交叉保護可能導致的O26食品風險增加的現象。在食品實際生產加工中，當多種措施聯合應用時食源性致病菌的風險評估及如何科學有效控制值得加強重視。