G-四聯體與聚合酶鏈式反應聯用可視化檢測沙門氏菌

劉健慧，耿鳳珍，張先舟，高 浩，李 聰，高 潔，檀建新,*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.河北大學附屬醫院，河北 保定 071000）

沙門氏菌（Salmonella）是常見的食源性致病菌，可通過污染食品進入腸道，經大量繁殖后引起嘔吐、腹痛、腹瀉。全世界每年由沙門氏菌導致的患病人數高達9 380萬，死亡15.5萬 人[1-4]。其中，因食用被其污染的畜產品致病的人數占沙門氏菌病例的75%，是爆發公共健康問題的主要原因[5-7]。近年來，抗生素的濫用、細菌自身耐藥性的提升等都對食品安全問題構成了威脅[8-9]。

食源性病原菌因少量存在于食品中而易被背景微生物區系所掩蓋，難以識別[10]。從食品中高效準確識別和鑒定出病原菌是防范食品安全事件發生的前提。目前沙門氏菌的檢測方法有多種，各有優缺點。如：常規檢測法包括預富集、選擇性富集、選擇性培養基上培養和生化測試等步驟，雖特異性高，但耗時長，且對操作人員要求較高[11]。免疫學檢測法雖操作相對簡單、靈敏，但抗體的制備繁瑣、價格昂貴且不易得到[12]。隨著核酸等溫擴增技術的完善[13]，環介導等溫擴增技術[14]、滾環擴增技術[15]、跨越式滾環擴增技術[16]等均已用于致病菌的檢測，這些方法方便快捷、特異靈敏、不需復雜設備，但因其引物設計復雜、成本高，特別是由于氣溶膠污染容易出現假陽性等弊端，在一定程度上限制了其應用。核酸適配體[17]檢測法，具有特異、靈敏的優點，但適配體結構受環境因素影響大，與目標物不易結合成牢固的復合體，技術上仍有待完善。本實驗采用穩定性和實用性強的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術[18]，同時引入G-四聯體可視化檢測概念，可達到較其他檢測方法相近的直觀、定量的檢測效果[19]。

G-四聯體是富含鳥嘌呤（G）的DNA或RNA序列串聯重復形成的非規范的四聯結構，在真核端粒中過度表達，起到增殖或生長抑制作用[20-22]。Gellert等[23]通過X射線證明由4 個鳥嘌呤形成的共平面四分體，可通過氫鍵和堿基堆積作用形成穩定的G-四聯體，其結構有平行、反平行和混合式3 種形式[24]。穩定的G-四聯體可與氯高鐵血紅素（Hemin）結合，形成具有過氧化物酶活性的模擬酶（DNAzyme），催化H2O2與2,2’-聯氮-雙(3-乙基-苯并噻唑琳-6-磺酸)二胺鹽（2,2’-diazo-bis(3-ethylbenzothiazolyn-6-sulfonic acid) diamine salt，ABTS）由無色變為綠色[25]，基于這一原理，已實現對金屬離子[26-27]、核酸分子[28]等的信號放大檢測。由于這些檢測體系中最終信號的強弱與G-四聯體的量呈正比，因此，將G-四聯體序列（或其互補序列）偶聯到用于特異性識別目標核酸序列上，通過高效擴增目標序列，可實現G-四聯體的大量富集而將檢測信號放大，并用于目標序列的檢測。本研究將PCR的特異性、靈敏性與G-四聯體的DNAzyme酶學活性、生物傳感器特性相結合，以沙門氏菌invH基因為靶基因，設計并篩選出一對5’端偶聯G-四聯體反向互補序列的PCR擴增引物，通過對靶基因特異性擴增得到大量帶有G-四聯體的PCR產物，并形成G-四聯體結構，發揮DNAzyme活性，建立了針對沙門氏菌的G-四聯體與PCR聯用的可視化檢測方法，以期為食源性致病菌的靈敏、快速、直觀檢測提供一種新策略和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用菌株如表1所示，均由河北農業大學生物工程實驗室提供；引物由金唯智生物科技有限公司合成；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒天根生化科技有限公司；2×Es TaqMaster Mix（Dye）北京康為世紀生物科技有限公司；100 bp DNA ladder寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、瓊脂糖 北京全式金生物技術有限公司；Hemin、過氧化氫、二甲基亞砜 北京Solarbio公司；ABTS 美國Sigma公司；其他主要試劑均為國產分析純。

表1 本研究所用菌種Table 1 Strains used in this study

1.2 儀器與設備

MTH-012型旋渦混合儀 海門其林貝爾儀器制造有限公司；070-851型PCR儀 德國Biometra公司；DYY-10 C型電泳儀 北京市六一儀器廠；JY04S-3E型凝膠成像分析系統 北京科普爾科技發展有限公司；K5500型超微量核酸測量儀 北京凱奧科技發展有限公司；iMark酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌基因組提取

取1 mL過夜培養菌液，提取細菌基因組DNA，具體操作方法見細菌基因組DNA提取試劑盒說明書。用核酸測量儀對其DNA濃度及純度進行測定。

1.3.2 引物設計

根據PCR引物設計原則設計出用于特異性識別和擴增invH序列的上下游引物，上游引物（H-F）序列為：5’-GAAAGAGCAACTGGCCAACG-3’，下游引物（H-R）序列為：5’-ATGCTTGAGCTGATTGC GC-3’，并在引物的5’端外加一段G-四聯體的反向互補序列，修飾后的上游引物（G-F）序列為：5’-CCCACC CACCCACCC GAAAGAGCAACTGGCCAACG-3’，修飾后的下游引物（G-R）序列為：5’-CCCACCCA CCCACCC ATGCTTGAGCTGATTGCGC-3’，其中5’-CCCACCCACCCACCC-3’為G-四聯體序列(G3T)3G3的反向互補，其在K+離子存在條件下形成平行G-四聯體結構，并且隨著富G序列的不斷延長，其穩定性無明顯變化，可視化反應較明顯[29]。

1.3.3 PCR反應體系與條件優化

以沙門氏菌基因組DNA為模板，用H-F/R作引物PCR擴增目標序列，膠回收，獲得的PCR產物經核酸蛋白儀測定濃度后作為后續實驗的模板。

以G-F/R為引物，進行G-四聯體與PCR擴增聯用可視化檢測體系的優化。首先，在無模板PCR體系中，觀測1、2、3、4、5、6、8、10 μmol/L引物濃度下引物二聚體形成及對G-四聯體顯色反應的影響；之后進行引物濃度與模板質量濃度之間的優化；確定最適引物濃度后再進行不同循環數與模板質量濃度的PCR。引物濃度梯度設置為2、3、4、6 μmol/L；循環數梯度設置為20、23、25、28、30 個循環。

各優化組經過可視化判斷，最終確定PCR反應體系為：50 μL 2×Es TaqMaster Mix（Dye），4 μL上、下游修飾引物G-F/R（4 μmol/L），4 μL DNA模板，用無菌ddH2O補至100 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，72 ℃延伸5 min，30 個循環。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳（140 V、40 min）鑒定，利用凝膠成像系統對結果觀察分析。

1.3.4 G-四聯體與PCR聯用的可視化反應體系優化

按照DNA純化回收試劑盒步驟回收的PCR產物中加入30 μL K+緩沖液（40 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、0.05% Triton-X）與15 μL不同終濃度Hemin工作液充分混勻，終濃度梯度設置為2、4、6、8、10 μmol/L。在PCR儀中95 ℃加熱使PCR產物變性，變性時間梯度設置為1、3、5、8、10 min。之后以2 ℃/s的速率從95 ℃降溫至4 ℃，并于4 ℃孵育，完成G-四聯體折疊，孵育時間梯度設置為5、10、20、30、40 min。最終加入50 μL的ABTS（1.28 mmol/L）和H2O2（1.28 mmol/L）進行顯色反應。室溫顯色5 min后，酶標儀測量421 nm處的吸光度，選擇最優的可視化結果進行后續實驗。

1.3.5 G-四聯體與PCR聯用可視化的特異性檢測

為驗證構建方法的特異性，分別對表1中16 株菌的基因組DNA進行提取，其中包括7 株沙門氏菌和9 株非特異性菌株。根據優化實驗得出的最佳反應條件和最優反應體系進行G-四聯體與PCR擴增方法聯用檢測，測定421 nm的吸光度，驗證構建的可視化檢測方法檢測沙門氏菌的特異性。

1.3.6 G-四聯體與PCR聯用可視化的靈敏度檢測

過夜培養的甲型副傷寒沙門氏菌，取1 mL進行基因組DNA的提取，之后將所提取的核酸進行梯度稀釋并測其核酸含量，按照已經優化好的條件進行PCR擴增，再利用純化產物進行G-四聯體顯色反應，421 nm波長處比色測定，以檢測該方法的靈敏度。

1.3.7 G-四聯體與PCR聯用可視化檢測法對人工污染牛奶樣品中沙門氏菌的檢出限

取過夜培養的沙門氏菌，0.85%的生理鹽水進行10 倍梯度稀釋，每個稀釋度各取1 mL進行菌落計數。用上述各稀釋度菌液5 mL接種于45 mL滅菌的牛奶中，均質后各取1 mL提取基因組DNA，作為檢測的模板，對G-四聯體與PCR擴增聯用的人工污染牛奶進行檢出限分析。

1.3.8 G-四聯體與PCR聯用可視化檢測法的實際應用與評價

為檢驗G-四聯體與PCR聯用方法在實際樣品中的檢測效果，在當地各大超市及市場隨機購買30 份容易被沙門氏菌污染的樣品，包括散裝牛奶10 種、鮮雞蛋10 種、鮮肉10 種。根據上述反應程序，以30 份實際樣品提取的DNA進行G-四聯體與PCR聯用可視化檢測實驗，同時按GB 4789.4—2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》方法檢測，其結果作為對照。

1.4 數據處理

數據的處理計算及標準曲線的繪制均采用Microsoft Excel 2010軟件分析。

2 結果與分析

2.1 PCR反應體系與反應條件優化

2.1.1 無目標模板時引物濃度對G-四聯體與PCR聯用的可視化顯色效果影響

與常規PCR引物相比，本研究在引物的5’端額外加了G-四聯體的反向互補序列，使得引物長度增加且結構復雜，可能更易于二聚體的形成，引起非特異性擴增，甚至影響G-四聯體結構，從而造成背景信號增大，干擾檢測結果。為排除這種可能性，把引物稀釋成10、8、6、5、4、3、2、1 μmol/L系列濃度，對其進行G-四聯體與PCR聯用的可視化顯色觀察和檢測。由圖1A可知，不同引物濃度下，無模板PCR體系經擴增后未產生目的條帶，而引物二聚體的增加與引物濃度呈正比；由圖1B可知，不同引物濃度下，引物二聚體的存在對于顯色的影響用肉眼難以區分，421 nm波長處吸光度較空白略有增加，但不同引物濃度間差異不明顯。因此，當PCR體系中無目標模板DNA時，引物濃度高低對G-四聯體與PCR聯用的可視化顯色效果無明顯影響。

圖1 無靶標模板PCR體系中引物濃度對G-四聯體顯色反應的影響Fig.1 Effects of different primer concentrations in PCR system without target templates on the chromogenic reaction of G-quadruplex

2.1.2 PCR體系中引物濃度對模板質量濃度的優化

由PCR擴增原理知，當模板質量濃度固定時，在一定范圍內隨著引物濃度的增加，PCR產物也會增多，反之亦然。因此，在DNA擴增過程中，引物濃度與模板量之間存在著相互作用關系，找到兩者之間相對合適的濃度對于確定PCR檢測到的模板最低量至關重要。圖2顯示，當引物濃度達到4 μmol/L時，模板檢出限為500 fg/μL，且不再隨著引物濃度的增加而改變，因此選用引物濃度4 μmol/L作為后續實驗基礎。

圖2 引物濃度對模板質量濃度優化電泳圖Fig.2 Optimization of ratio of primer concentration to template concentration

2.1.3 PCR擴增循環數的優化

循環數優化也是G-四聯體與PCR聯用可視化檢測方法構建中的重要環節，循環數的多少直接影響PCR產物及G-四聯體的生成量。循環數少會影響靈敏度，循環數過多，又會導致不同模板質量濃度的PCR擴增產物之間差異不明顯，所以找到一個適合的循環數非常重要。在引物濃度設定為4 μmol/L的基礎上，可通過循環數與模板質量濃度之間的合適條件確定循環數。

陰性對照以無菌ddH2O替代模板，圖3顯示，隨著模板質量濃度的降低，A421nm比色結果與陰性對照之間的差異越來越小。不同的循環數比較，28、30 個循環對模板的檢出效率遠高于20、23、25 個循環，檢出限更低，且30 個循環可視化效果最為明顯，故選擇30 個循環進行后續實驗。

2.2 G-四聯體與PCR擴增聯用可視化檢測顯色條件的優化

2.2.1 Hemin終濃度的優化

Hemin濃度會直接影響與G-四聯體結合后的復合體催化活性的強弱。將Hemin在檢測體系內的終濃度設置為2、4、6、8、10 μmol/L進行孵育，以此探究檢測體系中的最適Hemin的濃度。由圖4A可以看出，隨著Hemin濃度逐漸增大，體系吸光度逐漸增大，當濃度到達6 μmol/L以后，檢測體系的吸光度幾乎達到飽和，趨于平穩，故選擇Hemin的終濃度為6 μmol/L。

2.2.2 95 ℃變性時間的優化

帶有G-四聯體互補序列的上下游引物經過PCR擴增后，含有G-四聯體序列的雙鏈不斷積累，在互補堿基之間的氫鍵、堿基堆積力等分子作用力下會形成穩定的DNA雙螺旋結構，影響G-四聯體形成。高溫可以引起雙鏈DNA變性成單鏈，而富G序列在單鏈時才會組裝形成特有的結構，最終達到G-四聯體的顯色效果。因此，使雙鏈DNA充分變性，是G-四聯體形成的前提。由圖4B可知，當變性時間為1 min時，就能夠出現肉眼可見的顏色變化，說明雙鏈DNA遭到破壞同時形成了G-四聯體；隨著95 ℃變性時間的延長，顯色體系吸光度逐漸增大，且在8 min時達到了峰值，之后呈現較為平穩的狀態，吸光度不再有較大的波動，說明當溫度達到95 ℃且變性8 min后，該體系中的雙鏈達到全部解鏈的狀態，因此選用8 min的變性時間進行后續實驗。

2.2.3 4 ℃孵育時間的優化

PCR擴增產物中的雙鏈最大程度的變性為單鏈，可保證G-四聯體的形成量達到最多，那么從95 ℃到4 ℃的急速降溫可使高溫下變性成的單鏈DNA盡量維持其單鏈狀態，又為G-四聯體保持穩定打下基礎。由圖4C可知，當4 ℃孵育時間達到5 min時就已經有了肉眼可辨的顏色變化，當孵育時間達到10 min時，吸光度達到了最大，而后續隨著孵育時間的延長，反而吸光度趨于下降。表明在10 min時，DNA復性成雙鏈的速率還較低，且單鏈DNA與Hemin發生結合的幾率大，吸光度高。而隨著4 ℃溫育時間的延長，單鏈自身恢復雙螺旋結構的速率加快，與Hemin的復合效率變低，使得吸光度出現下降趨勢。所以選用4 ℃孵育時間10 min進行后續的顯色實驗。

圖4 Hemin濃度（A）、95 ℃變性時間（B）和4 ℃孵育時間（C）的優化Fig.4 Optimization of hemin concentration (A), denaturation (95 ℃)time (B) and incubation (4 ℃) time (C)

2.3 G-四聯體與PCR聯用可視化檢測沙門氏菌的特異性

為評價該方法的特異性，分別對表1中16 株菌的基因組DNA進行提取，根據優化實驗得出的最佳反應條件和最優反應體系進行PCR擴增和G-四聯體顯色，在保證其他菌株的DNA濃度遠大于沙門氏菌DNA濃度且其他條件相同下，驗證構建的可視化檢測方法對沙門氏菌的特異性。由圖5可知，只有含目標菌基因組DNA（沙門氏菌基因組DNA）的反應體系發生了明顯的顏色變化，其他含非目標菌基因組DNA的反應體系均未變色，證明G-四聯體與PCR聯用可視化檢測法對沙門氏菌具有高度的特異性。

圖5 G-四聯體與PCR擴增聯用可視化檢測方法的特異性Fig.5 Specificity of the visual detection method

2.4 G-四聯體與PCR聯用可視化檢測靈敏度的確定

取1 mL培養過夜的沙門氏菌進行基因組DNA的提取，之后將所提取的核酸進行梯度稀釋并測其核酸含量，得到0.07、0.7、9.7、79.9、771.6 ng/μL的模板樣品，在優化的反應條件和反應體系下進行G-四聯體與PCR聯用可視化檢測，以確定用沙門氏菌基因組作模板時該方法的檢出限。由圖6A可知，空白對照顏色無明顯變化，且吸光度隨著沙門氏菌基因組DNA濃度的增加，顏色也越來越深。由圖6B可見，模板質量濃度對數（lgC）與吸光度之間存在良好的線性關系，線性回歸方程為y=0.129 9x+0.217 9，R2=0.994 5，靈敏度達到0.07 ng/μL，說明構建的G-四聯體與PCR聯用可視化檢測方法的靈敏度效果好，足以對沙門氏菌屬進行有效鑒別和定量檢測。

圖6 G-四聯體與PCR擴增聯用可視化檢測方法的靈敏度Fig.6 Sensitivity of the visual detection method

2.5 G-四聯體與PCR聯用可視化檢測法對人工污染牛奶樣品中沙門氏菌的檢出限分析

利用G-四聯體與PCR擴增聯用可視化檢測方法對沙門氏菌標準菌株污染的牛奶進行檢測，其中人工污染的牛奶中菌濃度為1.2×105～1.2×101CFU/mL，由圖7可知，當污染牛奶中的菌濃度為1.2×105～1.2×102CFU/mL時，顯色較為明顯，檢出限為1.2×102CFU/mL，因此所建立的G-四聯體與PCR擴增聯用可視化檢測方法便捷有效，可應用于實際檢測中。但此次檢測靈敏度相比于純菌的檢出限高，可能是由牛奶中蛋白含量高降低了基因組DNA的提取效率所致。

圖7 G-四聯體與PCR擴增聯用可視化檢測人工污染沙門氏菌的牛奶樣品Fig.7 Application of the visual detection method to artificially contaminated samples

2.6 G-四聯體與PCR聯用可視化的實際應用與評價

對市場采集的30 份樣品分別采用可視化檢測與國標檢測，結果如表2所示，國標檢測方法檢測沙門氏菌陽性2 例，采用G-四聯體與PCR聯用可視化檢測得到相同的檢測效果，檢測準確率高達100%，說明本實驗構建的方法可實現對市售樣品的準確檢測，具有實際應用潛力。

表2 實際樣品檢測效果的評價Table 2 Evaluation of the visual detection method for actual samples in comparison with the national standard method

3 討論與結論

目前，關于PCR與G-四聯體反應相結合的方法，已有對單核增生李斯特菌[30]、幽門螺桿菌[31]、乙肝病毒[32]的檢測報道。但其研究或達不到定量效果；或只在引物的一端加入G-四聯體的互補序列，導致反應循環數多且目標產物低；或是設計了復雜的催化信標探針，增加了操作難度。本實驗將PCR擴增與G-四聯體聯用建立的可視化的沙門氏菌檢測方法，具有如下特點，一是利用PCR的特異性識別和高效擴增目標DNA的特點，既可以通過引物與沙門氏菌特異性基因片段識別保證檢測方法的特異性，又可以通過DNA的高效擴增積累大量的與擴增產物相連的G-四聯體序列，增強靈敏度。二是利用G-四聯體/Hemin的DNAzyme高效催化活性，催化H2O2將無色的ABTS2-氧化為綠色的ABTS*-。通過上述過程，可將兩次放大的信號轉變成肉眼可見的顏色變化，通過酶標儀可實現對沙門氏菌的高效、靈敏的定量檢測，同時也可以通過裸眼觀察顏色變化做出半定量或定性分析，避免了PCR凝膠電泳過程及EB污染等問題。

G-四聯體作為一種模擬酶，與蛋白質結構的酶相比，具有較高化學穩定性、結構簡單便于合成、易于修飾改良性狀等特點，如何巧妙地利用G-四聯體的過氧化物酶活性和生物傳感器特性，是當前人們關注的焦點之一[33]。要實現PCR擴增和G-四聯體聯用可視化檢測沙門氏菌，關鍵在于如何獲得大量G-四聯體展現其酶學特性，進而提高靈敏度。本研究主要采取如下措施：1）在設計引物時選擇了隨著富G序列的不斷的延長，其穩定性無變化，可視化反應明顯的平行G-四聯體結構，提高反應的靈敏度[29]；2）引物濃度與PCR擴增循環數是決定最終生成帶有G-四聯體序列的擴增產物量的關鍵因素，引物濃度低或擴增循環數少，生成的PCR產物及附帶的G-四聯體的量少、顯色淺，影響靈敏度。循環數過高，雖然靈敏度提高了，但是過高的擴增結果將影響顯色的梯度，掩蓋了模板濃度（菌體濃度）的差異。因此，根據本研究結果選擇4 μmol/L及以上濃度，擴增循環數在30左右，即可獲得較高的靈敏度和較好的顯色梯度效果。3）實驗發現在引物上同時標記G-四聯體的互補序列，無目標模板條件下擴增后不會造成本底信號的明顯增加，也不影響有目標模板時PCR正常擴增，同時能在較少的循環數下，實現產物的大量積累（如相同循環數下獲得的G-四聯體的量理論上至少是不對稱PCR法的2 倍）[34]，得到較好的可視梯度變化。4）與通過不對稱PCR及核酸外切酶酶切等方式獲取單鏈DNA相比[35-36]，本實驗直接將PCR產物熱變性，且在變性前加入Hemin工作液，使DNA雙鏈解旋成富G單鏈DNA過程與Hemin結合形成G-四聯體同時進行，減少了操作步驟和成本，縮短了檢測時間。

總之，通過上述實驗設計和一系列優化策略，建立了G-四聯體與PCR聯用可視化檢測沙門氏菌的方法，該方法特異性強、靈敏度高、穩定性好、操作簡便、易于觀察、成本低，適合實地定性檢測或借助酶標儀實現高通量檢測，為食源性致病菌在核酸檢測方面提供了新策略和思路。但實樣檢測與純菌樣品檢測相比，由于DNA提取效率降低，將影響靈敏度；另外，針對不同實際樣品，可能需要摸索和建立目標病原菌的菌數對數、提取的基因組濃度與吸光度之間的函數關系曲線，才能實現有效準確地檢測。