串聯(lián)毛細管手性柱分離薄荷醇的8 種光學異構體

司曉喜，張鳳梅，劉志華，陳 歡，何 沛，劉春波，楊建云，付亞寧，許志剛，朱瑞芝,*

（1.云南省煙草化學重點實驗室，云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231；2.國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心，河南 鄭州 450001；3.昆明理工大學理學院，云南 昆明 650500）

薄荷醇是一種廣泛使用的調味劑和藥物成分[1-6]，其結構有3 個手性碳，有8 種旋光異構體（4 對對映異構體），分別是D/L-薄荷醇、D/L-新薄荷醇、D/L-異薄荷醇和D/L-新異薄荷醇[7]，8 種薄荷醇旋光異構體的結構示意圖見圖1。不同構型的薄荷醇具有不同的呈香性和生物效用，其中L-薄荷醇具有明顯的薄荷香氣和清涼作用，并可用作刺激藥，應用價值最大，而其他薄荷醇異構體則帶有明顯的霉味等不良氣息或刺激性[8-11]。不同來源的薄荷醇由于異構體含量和構型組成不同[12]，產生的薄荷香氣、涼感和藥用功效具有差異，特別是L-薄荷醇純度較低時，嚴重影響產品品質。建立薄荷醇異構體構型分析技術對含薄荷醇產品的質量控制、品質評價具有重要價值。

圖1 8 種薄荷醇旋光異構體結構示意圖Fig.1 Structural diagrams of eight menthol optical isomers

目前，有關薄荷醇含量測定和應用技術開發(fā)已有大量報道[13-14]，對薄荷醇異構體則主要關注D-薄荷醇和L-薄荷醇對映體的分離，采用的分離檢測方法主要有手性柱分離-氣相色譜-質譜聯(lián)用法[15-18]、柱前衍生化-反向高效液相色譜法[19]、正向液相色譜法[20]等，其中以氣相色譜-質譜聯(lián)用法檢測法最為簡單便捷。Chen Cai等[15]采用手性毛細管氣相色譜柱、頂空-氣相色譜-質譜聯(lián)用儀分離檢測了煙草制品中的D-薄荷醇和L-薄荷醇，并進一步采用二維氣相色譜-飛行時間質譜篩查其他薄荷醇異構體，但由于缺乏標準品并未能準確識別其他薄荷醇異構體。Heumann等[21]利用手性試劑衍生化、19F核磁共振譜實現(xiàn)了8 種薄荷醇異構體的分離和定性，但該方法需要復雜的前處理和多步化學反應步驟，難于用于復雜樣品基質中薄荷醇異構體的分離和定量檢測。對復雜基質中8 種薄荷醇異構體的分離檢測仍然是個難題，由于缺乏薄荷醇旋光異構體的分析方法，無法準確獲得含薄荷醇產品中薄荷醇旋光異構體存在和分布情況的完整信息。

本實驗通過研究不同固定相的毛細管氣相色譜柱對8 種薄荷醇旋光異構體的分離效能，擬建立薄荷醇旋光異構體的串聯(lián)手性毛細管柱分離、氣相色譜-質譜檢測法測定，并用于不同類型含薄荷醇食品、藥品中薄荷旋光異構體的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售16 種含薄荷醇藥品（Y1～Y16，其中Y1～Y6為皮膚外用油，Y7～Y11為片劑，Y12為吸入劑，Y13為顆粒，Y14～Y15為外用膏劑，Y16為貼膏）；市售25 種含薄荷醇糖果（T1～T25，其中T1～T14為硬質糖果，T15～T19為軟糖，T20～T25為膠基型口香糖）。

甲醇、無水乙醇（均為色譜純） 德國Merck公司；8 種薄荷醇旋光異構體標準品、乙酸苯乙酯信息參見表1。

表1 8 種薄荷醇旋光異構體標準品和內標物質信息Table 1 Information about 8 menthol optical isomer standards and internal standards

1.2 儀器與設備

Clarus 600氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國Perkin Elmer公司；KQ-700 V型超聲波清洗器（配有溫控功能，功率≥200 W） 昆山市超聲儀器有限公司；BT224S電子天平（感量0.000 1 g） 德國賽多利斯科學儀器有限公司；3K15高速臺式離心機 德國Sigma公司；0.22 μm有機系濾膜 天津市津騰實驗設備有限公司；彈性毛細管氣相色譜柱見表2。

表2 實驗用毛細管色譜柱Table 2 List of capillary columns used in this stuty

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

配制系列質量濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的8 種薄荷醇異構體混合標準溶液，并加入乙酸苯乙酯內標使內標質量濃度均為20.0 μg/mL。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取一定量的樣品，藥品樣品以含20.0 μg/mL乙酸苯乙酯內標的乙酸乙酯作萃取劑，糖類食品以含20.0 μg/mL乙酸苯乙酯內標的甲醇作萃取劑，樣品量和溶劑用量比例一般為1∶100（g/mL）（溶劑用量根據(jù)樣品中薄荷醇異構體含量進行調整），加蓋密閉后于常溫下超聲萃取，片劑藥品、顆粒藥品、貼膏、硬質糖果、軟糖萃取時間為10 min，外用膏劑萃取時間為5 min，吸入劑、外用油、膠基型口香糖萃取時間2 min，萃取完成后萃取液轉移至離心管，以8 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機系濾膜后進樣分析。若樣品中薄荷醇異構體含量超過標線質量濃度范圍，用萃取劑稀釋后再進行測定。不加入樣品，按照同樣的前處理方法，進行空白實驗。

1.3.3 分析條件

氣相色譜條件：進樣口溫度200 ℃；傳輸線溫度230 ℃；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；進樣量1 μL；分流進樣（分流比10∶1）。DB-5MS、DB-624、DBALC1和DB-INNOWAX毛細管色譜柱，程序升溫條件：初始溫度60 ℃，以5 ℃/min的速率升至120 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min，載氣流速DB-624柱為2.0 mL/min，其余為1.0 mL/min。BGB-175、CycloSil-B手性毛細管色譜柱，程序升溫條件：初始溫度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升至100 ℃，以1 ℃/min的速率升至130 ℃，以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，載氣流速為1.0 mL/min。CycloSil-B+BGB-175串聯(lián)手性毛細管柱，升溫程序條件：初始溫度50 ℃，以3 ℃/min的速率升至120 ℃，保持16 min，再以10 ℃/min升至200 ℃，保持10 min，載氣流速1.2 mL/min。

質譜條件：電子電離源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲8 min；檢測方法：總離子流掃描和選擇離子監(jiān)測模式，8 種薄荷醇異構體的監(jiān)測離子均為m/z71、81、95（定量離子m/z71），乙酸苯乙酯的監(jiān)測離子為m/z104、91（定量離子m/z91）。

1.3.4 定量計算

對系列標準溶液進行測定，以標準溶液中各薄荷醇旋光異構體的定量離子峰面積與乙酸苯乙酯定量離子峰面積的比值為縱坐標，各薄荷醇旋光異構體的質量濃度和乙酸苯乙酯質量濃度的比值為橫坐標，繪制標準曲線，內標法定量。樣品中各薄荷醇旋光異構體的質量濃度根據(jù)標準曲線計算得出，樣品中各薄荷醇旋光異構體的含量按下式計算：

式中：X為各薄荷醇旋光異構體的含量/（mg/g）；C為由標準曲線得出的試樣中各薄荷醇旋光異構體的質量濃度/（mg/L）；C0為由標準曲線得出的空白中各薄荷醇旋光異構體的質量濃度/（mg/L）；V為萃取液體積/L；M為試樣質量/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗中所有數(shù)據(jù)采用平均值表示，所有指標均重復測定3 次；采用Origin 2017軟件進行不同樣品中薄荷醇異構體構型比例的主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 色譜分離條件考察

2.1.1 常規(guī)色譜柱分離薄荷醇旋光異構體測定

薄荷醇極性較小，常采用非極性或弱極性毛細管氣相色譜柱進行分離，也有報道極性和中等極性色譜柱能實現(xiàn)薄荷醇的分離并獲得良好的峰形，定量分析時通常以L-薄荷醇或外消旋的薄荷醇為標準品進行含量計算[22-26]。實驗研究了常用非極性的DB-5MS柱、中等極性的DB-624柱、極性的DB-INNOWAX柱、特殊鍵合固定相DBALC1柱對8 種薄荷醇旋光異構體分離的效果，見圖2。可以看出，在優(yōu)化的色譜分離條件下，以上4 種色譜柱均對薄荷醇有良好的保留，實現(xiàn)4 對薄荷醇對映異構體D/L-薄荷醇、D/L-新薄荷醇、D/L-異薄荷醇、D/L-新異薄荷醇的分離，但不能實現(xiàn)每對對映體D型和L型旋光異構體的分離。對于薄荷醇的4 對對映異構體，物理性質如蒸汽壓和沸點在同一對映體對內相同，但非對映體不同，而以上固定相對對映異構體無選擇性，因而不能分離同一對映體。對比不同的固定相，不同薄荷醇對映異構體的流出順序不同，分離度也存在差異，其中極性DB-INNOWAX柱分離4 對薄荷醇對映異構體的效果最佳。根據(jù)以上分離情況可知，采用非手性柱分離測定薄荷醇含量時，只包含了D/L-薄荷醇，忽略了其中所含的其他對映異構體新薄荷醇、異薄荷醇和新異薄荷醇。

圖2 常規(guī)色譜柱DB-5MS（a）、DB-624（b）、DB-ALC1（c）和DB-INNOWAX（d）分離8 種薄荷醇旋光異構體標準溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatogram of eight menthol optical isomer standards separated on conventional columns such as DB-5MS (a),DB-624 (b), DB-ACL1 (c) and DB- INNOWAX (d)

2.1.2 手性柱分離薄荷醇旋光異構體測定

環(huán)糊精類固定相由于獨特分子結構及多個不同的碳手性中心，具有廣泛的手性識別能力，但天然環(huán)糊精熔點高、成膜性能差，故常對其進行衍生和選擇性修飾，提高手性識別的程度和應用范圍，已成為最為廣泛應用的手性固定相。目前已有較多的研究報道采用環(huán)糊精類毛細管氣相色譜柱實現(xiàn)部分薄荷醇旋光異構體的分離，認為薄荷醇的六元環(huán)部分伸入到環(huán)糊精疏水性空腔內，不同手性中心與環(huán)糊精作用力的差異決定了手性識別過程[27-28]。不同環(huán)糊精空腔大小、不同取代基的環(huán)糊精表現(xiàn)出不同的手性分離能力，并可能改變分離物質的流出順序[17-18]。根據(jù)已有研究報道，選擇2 種取代基及空腔大小不同的環(huán)糊精手性柱進行研究，分別為含七-(2,3-二-O-甲基-6-O-叔丁基二甲基硅烷基)-β-環(huán)糊精的CycloSil-B手性柱、含2,3-二-O-乙酰基-6-O-叔丁基二甲基硅烷基-γ-環(huán)糊精的BGB-175手性柱，2 種色譜柱對8 種薄荷醇旋光異構體分離的效果見圖3。

圖3 手性色譜柱BGB-175（a）和CycloSil-B（b）分離8 種薄荷醇旋光異構體標準溶液的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatograms of eight menthol optical isomer standards separated on chiral columns BGB-175 (a) and CycloSil-B columns (b)

從圖3可以看出，除BGB-175手性柱未能完全分離D/L-異薄荷醇對映體外，其余對映異構體均能實現(xiàn)手性拆分，但由于柱效限制，不同對映異構體的D型和L型異構體色譜峰會發(fā)生重疊，從而不能實現(xiàn)8 種薄荷醇旋光異構體的完全分離。從圖3還可以看出，兩根色譜柱對部分薄荷醇旋光異構體的保留具有差異，即流出順序不同，例如在CycloSil-B色譜柱上未能實現(xiàn)分離的L-新薄荷醇和D-薄荷醇，以及D-異薄荷醇和L-異薄荷醇，在BGB-175色譜柱上則有較好的分離度。

2.1.3 柱串聯(lián)技術分離薄荷醇異構體研究及分離效果評價

由于單根色譜柱的柱效有限，以上實驗結果及已有報道均表明單一的手性色譜柱未能實現(xiàn)8 種薄荷旋光異構體的完全分離，即使通過增加色譜柱長度提高柱效也難于實現(xiàn)重疊峰的分離，而采用分離性能不同或互補的兩根或多根色譜柱串聯(lián)，則可能提高分離效果[29]。氣相色譜串聯(lián)技術簡易的解決方案是采用色譜柱連接器直接將兩根柱子串聯(lián)，根據(jù)上述實驗結果，CycloSil-B手性柱和BGB-175手性柱對8 種薄荷醇旋光異構體的分離能力具有差異并呈現(xiàn)互補，并且二者規(guī)格適配，因此研究了雙柱串聯(lián)對薄荷醇旋光異構體的分離能力。結果顯示，CycloSil-B+BGB-175雙柱串聯(lián)能實現(xiàn)8 種薄荷醇旋光異構體的分離，分離色譜圖見圖4。

圖4 串聯(lián)手性色譜柱CycloSil-B＋BGB-175分離8 種薄荷醇旋光異構體標準溶液的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion current chromatogram of eight menthol optical isomer standards separated on tandem chiral columns CycloSil-B + BGB-175

進一步通過色譜分離度和柱效率等對CycloSil-B+BGB-175雙柱串聯(lián)分離薄荷醇旋光異構體的效能進行評價。從圖4可以看出，除峰5（D-新異薄荷醇）和峰7（D-異薄荷醇）達到基本分離外，其余色譜峰均達到完全分離，滿足分離要求。通過計算對稱因子對色譜峰的對稱性進行評價，8 種色譜峰的對稱因子均在0.8～1.0，除L-新薄荷醇色譜峰略微前伸，其余色譜峰對稱性較好，表明兩根色譜柱兼容性較好，并能與薄荷醇異構體產生較強的作用力保證其在兩相中分配平衡，以保持色譜峰的對稱性。穩(wěn)定性方面，8 種薄荷醇選異構體的峰面積和保留時間均具有較好的日內和日間穩(wěn)定性。此外，柱流失也是影響信噪比（RSN）的關鍵因素，通過檢測中爐溫120 ℃、高爐溫200 ℃時的基線噪聲強度和柱流失質譜圖評價柱流失情況。雙柱串聯(lián)在120 ℃爐溫時柱流失變化不大，高溫時柱流失增加，但與單柱相比柱流失變化不明顯，通過基線的質譜圖主要識別出甲基聚硅氧烷的典型柱流失離子m/z207、73、281、355，以及改性環(huán)糊精上取代基叔丁基二甲基硅基等基團斷裂的碎片離子m/z75、89、57，但以上柱流失碎片離子與薄荷醇的定性、定量離子（m/z71、81、95）均不重疊，對薄荷醇異構體的分離檢測無明顯影響。采用建立的雙柱串聯(lián)分離方法，用于含薄荷醇的藥品、糖類食品等不同基質樣品的檢測，代表性樣品檢測的選擇離子流色譜圖見圖5，可以看出不同樣品中色譜峰分離情況良好，表明CycloSil-B+BGB-175雙柱串聯(lián)滿足不同樣品中薄荷醇旋光異構體分離檢測要求。

圖5 含薄荷醇的藥品（a）、糖類食品（b）和標準溶液（c）的選擇離子流色譜圖Fig.5 Chromatograms of menthol in drug (a) and candy (b) and standard solution (c) under selected ion monitoring mode

2.2 定量方法建立和評價

采用以上優(yōu)化的方法，取系列混合標準溶液進樣分析，以各薄荷醇異構體的定量離子峰面積與內標物乙酸苯乙酯定量離子峰面積的比值為縱坐標，質量濃度比值為橫坐標，繪制標準曲線。將不含薄荷醇的藥品和糖果的樣品測定20 次，以空白響應的3 倍標準偏差作檢出限，10 倍標準偏差作定量限。選取含薄荷醇的代表性藥品和糖果，按照上述實驗方法處理后測定，以7 次平行樣測定結果計算相對標準偏差。取不含薄荷醇的藥品和糖果，添加低、中、高3 個水平含量的薄荷醇異構體標準物質進行加標回收率實驗，其中L-薄荷醇添加質量濃度分別為20.0、100.0、200.0 mg/L，其他7 種薄荷醇異構體添加質量濃度分別為0.2、1.0、2.0 mg/L，結果列于表3。結果表明，在所考察質量濃度范圍內，8 種薄荷醇異構體的線性相關系數(shù)（r2）不小于0.998，方法的定量限為23.0～72.9 μg/L，檢測實際樣品相對標準偏差（relative standard deviations，RSD）不大于4.3%（n=7），加標回收率為86.0%～116.0%。

表3 線性相關系數(shù)、方法的檢出限、定量限、精密度和回收率Table 3 Linear correlation coefficients, limits of detection, limits of quantification, precision and recoveries

2.3 樣品測定結果

含薄荷醇的藥品和糖果中薄荷醇異構體檢測結果分別見表4、5。16 個含薄荷醇的藥品中檢測到的薄荷醇均以L-薄荷醇為主，除了一個樣品中L-薄荷醇比例為78.9%，其他藥物樣品中L-薄荷醇比例高于96.8%；除了兩個藥物樣品外均檢測到L-薄荷醇以外的其他異構體，并呈現(xiàn)不同的異構體分布特征，其中D構型薄荷醇檢出率高于L構型。25 個糖果食品中，L-薄荷醇比例為71.7%～100%，除了5 個糖果樣品外均檢測到L-薄荷醇以外的其他異構體，檢出率和含量較高的為D-新薄荷醇。D-新薄荷醇等雖然有一定的清涼感和薄荷味特征，但有較強的土樣或者發(fā)霉的不良氣味，L-薄荷醇以外的其他薄荷醇異構體是否會對食品風味和藥效帶來不良影響，還需結合其閾值等進一步評估[30-31]。

表4 藥物樣品中薄荷醇異構體含量和異構體純度檢測結果Table 4 Results of determination of menthol isomer contents and percentages in drug samples

目前報道在天然植物中未發(fā)現(xiàn)D-薄荷醇，并將D-薄荷醇的存在作為天然來源和合成薄荷醇的鑒別指標[12]，而本實驗檢測的部分樣品中檢測出微量D-薄荷醇，但是否能判斷以上樣品的薄荷醇來源于合成還需進一步確證。以往的方法由于未能實現(xiàn)D-薄荷醇的良好分離，存在未能檢測到微量D-薄荷醇的可能性。

表5 糖果樣品中薄荷醇異構體含量和異構體純度檢測結果Table 5 Results of determination of menthol isomer contents and percentages in candy samples

2.4 不同樣品中薄荷醇異構組成的PCA

不同樣品中薄荷醇異構體構型組成存在差異，進一步對不同樣品中薄荷醇異構體構型比例進行PCA。從圖6可以看出，通過PCA可以將16 種藥物、25 種糖果類食品按照其中所含薄荷醇的異構體比例進行一定的區(qū)分。通過對樣品中薄荷醇異構體的構型組成分析，可能為薄荷醇的來源鑒定、真?zhèn)螛悠疯b別等提供技術支持。

圖6 不同藥物（a）和糖果（b）樣品中薄荷醇異構體構型比例的PCAFig.6 PCA plots of percentages of menthol isomer configurations in different drug (a) and candy (b) samples

3 結 論

本實驗建立串聯(lián)手性毛細管柱分離、氣相色譜-質譜法檢測8 種薄荷醇旋光異構體的方法，并進行方法評價和驗證。建立的方法分離8 種薄荷醇異構體分離度好、響應值和保留時間具有較好穩(wěn)定性，成功用于不同類型藥品和糖果類食品中薄荷醇旋光異構體的定量分析，并獲得了不同樣品中薄荷醇旋光異構體含量和分布的完整信息。所檢測的藥品和糖果中薄荷醇異構體均以L-薄荷醇為主，大部分樣品中檢測到微量的其他薄荷醇異構體。未來工作中，可進一步結合覺察閾值等進一步評估薄荷醇異構體純度和含量對食品風味、藥物藥效等的影響。綜上所述，本實驗所建立的8 種薄荷醇旋光異構體的分離和定量檢測方法，在薄荷型食品、含薄荷醇藥物的質量控制和評價、薄荷醇產品來源識別等方面具有應用價值，并可應用于其他類型樣品的分析檢測。