超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定小麥粉中硫脲、曲酸、噻苯咪唑、噻二唑、四環素

王 妍，李志剛，趙文濤，郭文萍，李瑩瑩，王娟強，姜 銳

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

小麥是我國三大農作物之一，其富含豐富的碳水化合物及蛋白質，主要用途為小麥粉的生產原料。國家統計局公布的數據顯示，我國小麥產量逐年上升[1]，小麥粉生產和消費快速增長，其安全和質量問題一度十分突出。在小麥粉加工、制作過程中，生產者為了滿足小麥粉在感官性狀、筋力、蛋白含量、穩定性等方面的要求，通常選擇添加不同品種的優質小麥進行配粉，一些小作坊為了追求利益最大化，通過添加輔料或化學制劑的方式改善小麥粉的感官性狀，掩蓋原料本身質量不過關的事實；另外，小麥儲存條件如不符合國家標準，在儲藏過程中極易發生霉變或蟲鼠危害導致小麥粉污染。不法商販通過向小麥粉中添加增白劑、防腐劑和抗生素如硫脲[2-3]、曲酸、噻二唑[4]等非食品原料，使小麥粉達到出廠標準，這一行為會產生嚴重的食品安全風險，威脅消費者的身體健康[5-6]。為加強對小麥粉的監管，原國家食品藥品監督管理總局發布第132號公告《總局關于進一步加強小麥粉質量安全監管的公告》，其中第四條“嚴禁生產企業在小麥粉中添加過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚、過硫酸鹽、噻二唑、曲酸等非食品原料?！泵鞔_禁止面粉中添加硫脲、曲酸、噻二唑等物質[7]。

目前，有關報道發現在小麥粉中檢測出噻苯咪唑、四環素的藥物殘留，這嚴重影響了小麥粉的食品安全性。噻苯咪唑，是一種高效、低毒性的廣譜殺菌劑，可用于小麥病害防治[8]。噻苯咪唑的長期接觸或食入可能會導致免疫系統紊亂，嚴重威脅消費者健康。美國、日本等國家現已嚴格控制食品中該物質的殘留量，我國也將食品中噻苯咪唑的殘留量列為重要監測項目[9]。四環素是一種廣譜殺菌藥物，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用。對人體部分器官的細胞有很大的毒性，不僅會引起腸胃疾病，還會造成耐藥細菌的出現[10]。

目前，鮮見文獻報道同時測定小麥粉中這5種物質的檢測方法。申科敏等[11]用高效液相色譜法同時測定小麥粉中曲酸、噻二唑、硫脲，方法檢出限較高；目前食品中噻苯咪唑的檢測方法主要有氣相色譜法-串聯質譜法[12]、液相色譜法[13-14]、液相色譜-串聯質譜法[15-16]、表面增強拉曼法等[17]；四環素常見的方法有液相色譜法[18]、液相色譜-串聯質譜法[19-20]，檢測限均高于本方法。噻苯咪唑及四環素兩種物質均鮮報道在面粉基質中的檢測方法。本研究旨在采用超高效液相色譜-串聯質譜技術，建立一種高通量、高靈敏度的快速定量檢測方法，以期能夠同時檢測出小麥粉中硫脲、曲酸、噻二唑、噻苯咪唑、四環素5種物質，全面保障小麥粉的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉 市售。

硫脲（純度≥99.0%）、曲酸（純度≥98.0%）上海安譜科技股份有限公司；噻苯咪唑（純度≥98.9%）、四環素（純度≥97.15%） 德國Dr.Ehrensorfer公司；噻二唑（純度≥99.5%） 北京振翔科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜級），無水乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；水為一級水。

1.2 儀器與設備

1290高效液相色譜儀-6470串聯四極桿質譜、渦旋振蕩儀 美國Agilent公司；S-100渦旋儀 日本Taiyo公司；離心機 日本Hitachi公司；Milli-Q純水儀美國Millipore公司；HSC-24B水浴氮吹儀 天津恒奧科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取溶液及流動相制備

體積分數0.1%的甲酸溶液：移取甲酸1 mL，加水稀釋至1 L，混勻。

體積分數80%的乙醇溶液：量取無水乙醇400 mL，加水稀釋至500 mL，混勻。

1.3.2 樣品處理

稱2 g樣品，加入5 mL 80%乙醇溶液，渦旋2 min，用乙腈定容至10 mL。將樣品管置于高速渦旋儀，2 000 r/min，渦旋15 min。12 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于刻度管中，40 ℃水浴中氮吹干。加入1 mL 0.1%甲酸溶液，渦旋復溶，過0.22 μm濾膜，待上機。

1.3.3 標準溶液的制備

硫脲標準儲備液：稱取硫脲標準品10 mg用10 mL水溶解并定容，配制成質量濃度為1 mg/mL硫脲標準儲備液，4 ℃冷藏保存。

曲酸、噻二唑、四環素標準儲備液：稱取曲酸、噻二唑、四環素標準品10 mg，用10 mL甲醇溶解并定容，分別配制成質量濃度為1 mg/mL標準儲備液，-18 ℃冷凍保存。

噻苯咪唑標準儲備液：稱取噻苯咪唑標準品10 mg，用100%甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為100 μg/mL噻苯咪唑標準儲備液，-18 ℃冷凍保存。

混合標準中間液：移取硫脲、曲酸、四環素標準儲備液各1.00 mL，噻苯咪唑標準儲備液100 μL，噻二唑標準儲備液10 mL配制成混合標準工作液。其中硫脲、曲酸、四環素質量濃度為10 μg/mL、噻二唑質量濃度為100 μg/mL、噻苯咪唑質量濃度為100 ng/mL，4 ℃冷藏保存。

混合標準曲線的制備：配制基質標準曲線，分別稱取6 份空白小麥粉樣品，每份2 g，依次移取混合標準中間液20、50、100、200、500、1 000 μL添加到樣品中，使樣品充分吸收，參照1.3.2節前處理過程進行處理。標準曲線的最終質量濃度分別為（以硫脲為例）100、250、500、1 000、5 000 ng/mL。

1.3.4 超高效液相色譜-串聯質譜條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫30 ℃；進樣體積2 μL；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；流速0.30 mL/min。洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

質譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；正模式噴霧電壓3 000 V，負模式噴霧電壓2 500 V，輔助氣（氮氣）氣化溫度300 ℃，鞘氣（氮氣）流速11 L/min，鞘氣溫度350 ℃。多反應監測質譜參數見表2。

表2 5種物質多反應監測質譜參數Table 2 MRM mass spectrometric parameters for five substances

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

根據文獻資料顯示[21-25]，5種物質在反向色譜柱C18柱上均有保留，故實驗選取C18柱。

四環素容易在反相色譜柱的硅醇基上吸附，產生拖尾峰，需要在流動相中加入有機酸，才能取得較好分離度和峰形[26]。實驗分別選取0.1%甲酸溶液-甲醇、（0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液）-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈、（1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液）-乙腈4 種組合考察5種物質的保留及響應情況。結果表明，流動相含有乙酸銨時，負離子掃描模式下噻二唑的響應值較好，正離子掃描模式下的4 種物質的響應較低，曲酸和四環素的峰形較差。選擇0.1%甲酸溶液作為水相，曲酸、硫脲、噻苯咪唑、四環素的響應及峰形較理想，噻二唑響應可滿足實驗要求。有機相為乙腈和甲醇對5種物質的峰形和響應的影響不明顯，采用乙腈可以有效降低儀器系統內的壓力，最終選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相。

如圖1所示，5種物質因結構性的差異，與固定相之間產生的吸附力大小、強弱不同可以看出曲酸、硫脲極性較強，因此首先采用高比例的水相進行分離，硫脲和曲酸依次出峰。再加大有機相比例洗脫另外3 種物質，實現5種化合物較好的分離。

圖1 5種物質的結構式Fig.1 Structural formulae of five substances

2.2 質譜條件的優化

硫脲結構中含有氨基，曲酸吡喃環上連接酚羥基和羥甲基，噻苯咪唑和四環素的分子結構也較容易得到H+形成[M+H]+型分子離子峰，因此硫脲、曲酸、四環素、噻苯咪唑均選擇電噴霧離子正離子模式。噻二唑結構中含有一個巰基，易失去H+形成[M-H]-型分子離子峰，故化合物噻二唑選擇電噴霧離子負離子模式。分別配制1 μg/mL的標準溶液，每個化合物在相應的模式下進行全掃描和單離子掃描得到母離子并優化碎裂電壓，使母離子的豐度達到最優。隨后進行子離子掃描，找到兩個特征碎片離子，優化碰撞電壓，并選取豐度較高的子離子作為定量離子。5種化合物的總離子流圖、定量離子和定性離子圖，見圖2、3。

圖2 5種化合物的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of five compounds

圖3 5種物質的定量、定性及離子比例圖Fig.3 Quantitative and qualitative chromatograms and mass spectra of five substances

2.3 前處理過程優化

根據5種物質的溶解性和相關文獻資料的報道，實驗選擇甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、乙二胺四乙酸二鈉-Mcllvsine緩沖液、水、80%乙醇-乙腈（1∶1，V/V）作為提取溶劑進行比較。選擇乙二胺四乙酸二鈉-Mcllvsine緩沖液、水提取樣品并離心后，上清液較為渾濁，且僅有四環素回收率較好，其他化合物回收率均低于70%；甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、80%乙醇-乙腈（1∶1，V/V）沉淀蛋白效果較好，采用氮吹方式除雜和濃縮后回收率可得到較優結果。

實驗結果表明，添加100 μL混合標準中間液（1.3.1.2節），相當于硫脲、曲酸、四環素添加量為250 μg/kg，噻苯咪唑為2.5 μg/kg，噻二唑為2.5mg/kg時，采用80%乙醇溶液-乙腈（1∶1，V/V）混合體系為提取溶劑時，5 種物質的回收率可達到80%以上。綜上，本研究最終選擇80%乙醇溶液-乙腈（1∶1，V/V）作為提取溶劑，并采用氮吹方式除雜和濃縮。不同提取溶劑對回收率的影響見圖4。

圖4 提取溶劑對回收率的影響Fig.4 Effect of different extraction solvents on recoveries of five analytes

本實驗還考察不同復溶溶液對5 種物質回收率的影響。向空白樣品基質溶液中加入標準溶液后吹干，分別用1 mL 0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸溶液-乙腈（1∶1，V/V）、乙腈定容，渦旋混合后過0.22 μm濾膜上機測定。添加100 μL混合標準中間液（1.3.3節），相當于硫脲、曲酸、四環素添加量為250 μg/kg，噻苯咪唑為2.5 μg/kg，噻二唑為2.5mg/kg時，結果見圖5。0.1%甲酸溶液復溶樣品，5 種物質回收率較好，干擾小，峰形、響應均較為理想，故本實驗選取0.1%甲酸溶液作為復溶溶劑。

圖5 復溶溶液對5 種物質回收率的影響Fig.5 Effect of different redissolution solvents on recoveries of five analytes

2.4 方法學結果

2.4.1 基質效應

樣品經前處理后依然保留在待測液中的糖類、可溶性蛋白或肽類等有機化合物、無機鹽等雜質與目標化合物共流出，進入電離源，影響目標化合物的離子化效率，即基質效應[27]。引起目標化合物響應降低稱為基質抑制效應，響應升高為基質增強效應[28]。本研究通過提取后添加法評價5 種待測物在小麥粉中的基質效應[29]。將空白樣品按前處理步驟提取凈化后，向提取液中添加不同質量濃度的標準溶液，制作基質匹配標準溶液。另外制作一條用流動相配制的相同質量濃度梯度的溶劑標準溶液[30-31]。分別測定并根據質量濃度與峰面積繪制曲線得到兩條曲線斜率，根據下式計算基質效應[32]：

式中：A為基質匹配標準曲線斜率；B為溶劑標準曲線斜率。

實驗結果顯示，小麥粉基質對噻苯咪唑產生的基質效應不明顯，對噻二唑、四環素、曲酸、硫脲的測定存在基質抑制效應，見表3。有研究指出，處理生物樣品時不采用空白基質配制標準溶液法，而應采用空白基質標準前加標法消除或補償基質效應[34]。故本研究采用空白基質前加標法制作標準曲線，有效消除基質效應，降低硫脲、曲酸回收率低對結果準確性的影響[35]。

表3 小麥粉中5 種物質的基質效應評價Table 3 Matrix effect evaluation of five analytes in flour

2.4.2 線性、檢出限與定量限

稱取6 份空白小麥粉樣品，每份2 g，依次移取混合標準中間液20、50、100、200、500、1 000 μL添加到樣品中，按1.3.2節樣品處理過程操作，制作基質加標曲線。分別繪制線性方程，硫脲、曲酸、四環素線性范圍為100～5 000 ng/mL，噻苯咪唑線性范圍為1～50 ng/mL，噻二唑線性范圍為1～50 μg/mL，相關系數在0.999以上，線性關系良好，見表4。硫脲、曲酸、四環素檢出限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg。噻苯咪唑檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1 μg/kg。噻二唑檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1 mg/kg。檢出限滿足RSN≥3，定量限滿足RSN≥10。

表4 小麥粉中5 種物質的線性關系Table 4 Calibration curve equations of five analytes in flour

2.4.3 回收率與精密度實驗

選取空白小麥粉樣品，每份2 g，分別添加低、中、高水平標準溶液，每個添加水平做6 次平行實驗，結果見表5。結果表明3 個不同添加水平的回收率在88.6%～102.2%之間，相對標準偏差在0.7%～5.6%之間，均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》中要求。

表5 小麥粉基質中5 種化合物不同添加水平回收率結果Table 5 Recoveries of five analytes in flour matrix at different spiked levels

2.5 實際樣品的測定

按照本方法對市售25 批次小麥粉進行分析，其中1 批次檢測出噻苯咪唑殘留。本方法可用于實際樣品的快速定量檢測。

3 結 論

本實驗建立了一種利用超高效液相色譜-串聯質譜技術同時測定小麥粉中硫脲、曲酸、噻苯咪唑、噻二唑、四環素物質的檢測方法，其中硫脲、曲酸、四環素檢出限為25 μg/kg，定量限為50 μg/kg；噻苯咪唑檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1 μg/kg；噻二唑檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1 mg/kg。方法靈敏度、回收率高、重復性好、前處理操作簡便快速，在實際檢測中具有較強的可操作性，可以作為小麥粉中非法添加物的定量檢測方法。