不同植物DNA條形碼對鐵皮石斛鑒定能力的評價

陳文強，汪小福，陳笑蕓，彭 城，徐俊鋒，蔡 健

（1.浙江省農業科學院，農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，浙江 杭州 310021；2.阜陽師范大學生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）又稱黑節草，為蘭科石斛屬多年生附生型草本植物，為我國傳統珍貴中藥材之一，具有滋陰除熱、生津養胃等功效[1]，主要分布于我國南方地區如浙江、云南、貴州及安徽等地。鐵皮石斛含有豐富的多糖、生物素、氨基酸和微量元素，其有效成分具有增強免疫力、抗衰老、抗氧化、降血糖等生物作用[2]。鐵皮石斛的自然生長條件較為苛刻，通常位于1 600 m以上海拔的背陽山坡，喜潮喜濕、耐寒能力差[3]，生長周期較長，繁殖率低[4]。近代快速繁殖離體培養技術緩解了鐵皮石斛野生資源短缺的壓力[5]，但由于其優良的保健價值及人們對健康生活的追求，使得國內外對鐵皮石斛的需求量也逐年增加。在巨大的利益驅動下，市場上出現了利用性狀相似的金釵或紫皮石斛等充當鐵皮石斛。而石斛種類繁多，形態相似，特別是加工為成品如鐵皮楓斗后更加難以區分，造成了目前鐵皮石斛市場上“以假亂真”、“以次充好”等混亂現象。嚴重損害了消費者的正當權益及消費者對鐵皮石斛的信用，阻礙了鐵皮石斛產業健康可持續性的發展，迫切需要對鐵皮石斛建立精準的鑒別方法，以滿足其質量控制和市場監管的需要。

目前鑒定鐵皮石斛的方法主要包括傳統形態學鑒定、理化分析鑒定和DNA分子鑒定方法。傳統形態學通過觀察鐵皮石斛表面及顯微切片進行分析[6]，需要有較高的鑒別經驗，對材料的新鮮度與完整性要求較高，并且缺少明確鑒定鐵皮石斛的專屬性狀特征。理化性質鑒別通過一系列物理、化學分析方法，例如高效液相色譜技術[7]、固相萃取技術[8]以及紅外光譜[9]或者紫外光譜法[10]等對鐵皮石斛中所含成分進行分析，獲取其中具有鑒別價值的理化性質。其缺點是儀器費用高、材料前處理不易控制且微量分離鑒定效果不明顯。

DNA分子鑒別常用的有DNA分子標記技術和DNA條形碼技術等[11]。DNA條形碼技術是利用基因組中一段標準的、相對較短的DNA片段進行物種鑒定的分子鑒定新方法。目前，DNA條形碼技術在發現新物種和辨別混亂或錯誤物種方面應用頗多，線粒體基因細胞色素C氧化酶COI基因片段作為動物分類鑒定的通用DNA條形碼[12]，COI對真菌和藻類也有較高的分辨率，但植物的線粒體基因進化速率慢，因而COI不適合植物的物種鑒定。在植物方面，2009年，國際生命條形碼聯盟（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）推薦使用葉綠體基因片段rbcL和matK作為植物通用的DNA條形碼[11]。近年來，更多的葉綠體基因及核基因片段被用作植物的DNA條形碼。

許多學者開展了利用DNA條形碼對鐵皮石斛鑒定的研究。如付濤等[13]基于葉綠體DNA條形碼鑒定鐵皮石斛種質資源，認為rbcL和matK可作為鑒定鐵皮石斛的候選序列；丁小余等[14]對ITS全序列構建數據庫，并對序列進行分析，發現利用ITS序列可以成功鑒別石斛類的待檢品種；邵世光等[15]對石斛中trnH-psbA序列進行分析，發現trnH-psbA在不同石斛種間均存在差異，可用作石斛分子的鑒定；楊培[16]利用psbK-psbI對34 份石斛屬樣品進行檢測，成功鑒定出未知待檢樣品的品種。

目前研究多是利用一個或少數幾個DNA條形碼對石斛進行鑒定或分類，有待全面和深入研究。本研究選擇目前常用的9 種植物DNA條形碼（ITS2、nad1、matK、ycbL、psbK-psbI、trnL-trnF、trnG-trnS、rbcL和trnH-psbA），分別從擴增性、遺傳分化距離、序列特征分析等方面，全面系統地解析不同植物DNA條形碼對鐵皮石斛的鑒定能力，以期為鐵皮石斛鑒定選擇合適的DNA條形碼提供分子依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究采集到浙江省、安徽省、云南省以及廣西壯族自治區4 個地區25 份鐵皮石斛鮮樣和10 種不同種石斛屬鮮樣，共計35 份樣品，并由浙江省農業科學院于國光副研究員鑒定為相應的石斛材料。材料信息詳見表1。

表1 鐵皮石斛及其近緣屬材料信息Table 1 Information about leaf and stem samples of D.officinale and its related species

75%乙醇、瓊脂糖、TAE緩沖液50×、DNA Marker DL2000 生工生物工程（上海）股份有限公司；液氮、植物總DNA提取試劑盒 杭州新景生物有限公司；Prime STAR?HS Premix 寶日醫生物技術（北京）有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

Nanodrop 2000核酸蛋白分析儀 美國Thermo公司；96 孔超速梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Biometra公司；凝膠電泳儀 美國GE公司；全自動凝膠成像儀 上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

將選取的石斛組織（鮮葉、莖）用75%乙醇溶液擦拭，保存至-80 ℃備用。稱取100 mg石斛樣品，用液氮研磨，然后通過植物總DNA提取試劑盒方法提取石斛總DNA。使用Nanodrop 2000核酸蛋白分析儀檢測所提DNA濃度及純度，通過1%凝膠電泳判定DNA質量。稀釋至均一濃度后放入-20 ℃保存備用。

1.3.2 PCR擴增及產物測序

查閱文獻并結合前期實驗選定9 種常用植物DNA條形碼及其引物序列（表2），對所有DNA樣本進行PCR擴增。采用25 μL PCR擴增體系，包括12.5 μL Prime STAR?HS Premix、上下游引物1 μL（10 mmol/L）、DNA模板2 μL（約40 ng）、ddH2O 8.5 μL。PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測后，將得到的單一、明亮條帶，經膠回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

表2 DNA條形碼引物信息及來源Table 2 Primer sequences and reaction conditions used for amplification of DNA barcodes

1.3.3 生物信息學分析

利用Chromas3.0軟件對序列峰圖進行查看，并判斷測序結果是否理想。對于測序成功獲得的序列，采用ClustalW軟件，將測序兩端無用序列刪除，采用NCBI（National Center for Biotechnology Information）平臺的BLAST工具與數據庫進行比對。利用MEGA6.0軟件進行序列比對，分析測得核酸序列的長度、核苷酸組成、進行序列比對、變異位點分析。擴增率為實驗引物與所有待實驗石斛材料總DNA進行擴增，成功擴增材料與總研究材料之比。變異率為序列中所含變異位點與序列總堿基含量之比。種內遺傳距離的計算和系統發育鄰接（Neighbor-Joining，NJ）進化樹的構建利用的是K2P（Kimura 2-parameter）模型，Bootstrap的次數設為1 000 次，并自動刪除小于50%的數值，確定每個分支的支持率不小于50%，可判斷正確鑒定到種。利用SPSS 20.0中的Wilcoxon秩和檢驗對單片段DNA條形碼序列種間與種內遺傳距離進行評價，篩選出鐵皮石斛資源鑒定的DNA條形碼。

本研究序列分析軟件主要為Chromas3.0和ClustalW；遺傳距離計算與NJ進化樹構建則使用MEGA6.0；統計分析軟件為SPSS20.0；繪圖所使用軟件為Microsoft Office的Excel和PowerPoint。

2 結果與分析

2.1 序列測定與比對

9 條DNA條形碼序列在35 份石斛屬植物共得315 條序列。將所得序列均通過NCBI進行BLAST相似性檢驗。將比對的結果進行分類總結，測序所得序列與NCBI數據庫中已知的11 種石斛屬序列的同源性為100%（相應的序列號見表3），對比結果也說明本實驗的測序結果可靠準確。

表3 測序與GenBank對比DNA條形碼序列信息Table 3 Sequencing of DNA barcodes and comparison with GenBank sequences

2.2 不同條形碼特征分析

不同植物DNA條形碼序列的具體特征信息見表4。結果顯示，不同DNA條形碼的序列全長介于456～809 bp之間，trnG-trnS片段序列最長，平均為775 bp，ITS2基因序列最短，平均為457 bp。9 種DNA條形碼序列GC含量介于24.1%～57.9%，其中ITS2基因GC含量最高，平均為53.8%，trnG-trnS片段序列GC含量最低，平均為24.5%?？疾旄鱀NA條形碼的引物在不同材料中的擴增率，其中matK序列擴增率為91.4%，大包鞘石斛和束花石斛沒有得到擴增，可能是這2 個材料中的matK序列有變異或進化。其余8 條DNA條形碼擴增率均為100%；9 條DNA條形碼的測序成功率均為100%。變異率反映序列的變異程度，其中ITS2、trnL-trnF和trnG-trnS的變異率較高，均超過20%，說明這些序列進化速率較快。

表4 不同DNA條形碼基本特征信息Table 4 Basic characteristics of DNA barcode sequences

2.3 DNA條形碼遺傳距離分析

DNA條形碼應具有足夠小的種內變異與明顯的種間變異，在遺傳距離上即要求種內差異最大值小于種間差異最小值。對11 種石斛屬的9 條DNA條形碼序列進行種內與種間遺傳距離計算（表5）。結果顯示，在鐵皮石斛種內，nad1、matK、psbK-psbI、trnG-trnS的序列沒有變異，其在鐵皮石斛種內遺傳距離為0。種內遺傳距離大小順序為rbcL＞ITS2＞trnH-psbA＞trnL-trnF＞ycf1b。石斛屬種間遺傳距離統計結果顯示，ITS2的種間遺傳距離最大，平均為0.074 4，nad1的種間遺傳距離最小，平均為0.004 5。種間遺傳距離大小順序為ITS2＞trnG-trnS＞trnL-trnF＞psbK-psbI＞ycf1b＞rbcL＞matK＞trnH-psbA＞nad1。其中，rbcL與trnH-psbA種內最大遺傳距離大于種間最小遺傳距離，不符合DNA條形碼對遺傳距離的要求，其余條形碼種內最大遺傳距離小于種間最小遺傳距離。

表5 種內、種間遺傳距離Table 5 Genetic distances within and between species

進一步利用種內與種間K2P遺傳距離得到“barcoding gap”分布圖（圖1），ITS2、nad1、matK、ycf1b、psbK-psbI、trnL-trnF、trnG-trnS基因及片段序列存在“barcoding gap”，有小部分重疊。ycf1b、matK、nad1與psbK-psbI序列遺傳距離分布頻率在圖中整體分布呈正態分布向種內方向傾斜；ITS2、trnL-trnF及trnG-trnS序列種內變異差異和樣本分布的比例明顯較小，而品種間的樣本分布和變異差異明顯較大，有利于鐵皮石斛資源的鑒定。而rbcL與trnH-psbA序列不存在“barcoding gap”且品種間和品種內變異重合，不適合用于鐵皮石斛資源的鑒定。

圖1 不同DNA條形碼種內和種間K2P距離分布圖Fig.1 Distribution of interspecific and intraspecific K2P distances of different DNA barcodes

2.4 不同序列變異的Wilcoxon秩和檢驗

根據遺傳變異分化的不同，采用SPSS 20.0統計軟件對7 條候選DNA條形碼序列遺傳距離進行種間Wilcoxon秩和檢驗（表6），分析兩兩序列種間的變異情況作為篩選候補DNA條形碼的一個指標。根據P＜0.05為顯著性差異的原則，ITS2序列的檢驗值最大，其余序列種間距離變異差異大小順序為ITS2＞trnL-trnF＞trnG-trnS＞psbK-psbI＞ycf1b＞matK＞nad1，與種間變異分析結果一致。

表6 不同序列變異的Wilcoxon秩和檢驗Table 6 Wilcoxon rank sum test of different sequence variations

2.5 DNA條形碼鑒定分析

DNA條形碼分辨率是判斷選擇的條形碼是否合適的標準之一。通過NJ進化樹個體聚成一支且支持率不小于50%可認為鑒定成功。9 條DNA條形碼對本實驗中石斛屬材料的NJ聚類分析如圖2所示。ITS2、ycf1b、psbK-psbI以及trnL-trnF序列可將鐵皮石斛資源以近似50%的支持率，單獨聚為一支；其余3 種未能得到較好的區別，nad1序列將重唇石斛、鼓槌石斛、鉤狀石斛等7 種與鐵皮石斛聚為一支，matK序列將銅皮石斛、腫節石斛、重唇石斛等5 種與鐵皮石斛聚為一支；trnG-trnS序列將金釵石斛、喇叭唇石斛、重唇石斛等6 種與鐵皮石斛聚為一支。7 條DNA條形碼對鐵皮石斛的分辨率見表7。其中，nad1序列分辨率最低，為36.3%，ITS2與trnL-trnF序列分辨率最高，為90.1%。根據實驗結果，推薦使用ITS2和trnL-trnF序列作為鐵皮石斛資源鑒定的DNA條形碼。

表7 石斛屬種間分辨率Table 7 Interspecific identification rates of Dendrobium

圖2 基于多條DNA條形碼構建的NJ樹Fig.2 NJ trees constructed based on multiple DNA barcodes

進一步，將ITS2和trnL-trnF2個片段組合，進行NJ進化樹的構建（圖3）。通過NJ樹個體聚成一支且支持率≥50%可認為鑒定成功。圖3中每個分支的支持率均超過50%，11 種石斛都能成功鑒定。推薦使用ITS2+trnL-trnF組合序列作為鐵皮石斛資源鑒定的DNA條形碼。

圖3 基于ITS2＋trnL-trnF組合DNA條形碼構建的NJ樹Fig.3 NJ tree constructed based on ITS2 combined with trnL-trnF

3 討 論

DNA條形碼技術由于其受環境條件或材料品質等影響較小，所需樣品量少、鑒定準確性高、方便快速等優點，被廣泛應用到鐵皮石斛的鑒定[21]。目前，應用到植物鑒定和分類的DNA條形碼有很多，主要為葉綠體的基因片段，葉綠體基因的間隔區，還有來源核基因片段。本研究選擇了目前比較常用的植物DNA條形碼，其中葉綠體基因片段為rbcL、ycf1b、matK，葉綠體基因的間隔區trnH-psbA、psbK-psbI、trnL-trnF、trnG-trnS，ITS2為核基因片段，nad1則為線粒體基因。主要從通用性和分辨率等方面探討它們對鐵皮石斛鑒定的適合程度。

在通用性方面，主要比較了9 種DNA條形碼的擴增性和測序成功率。整體而言，通用性都比較強，其中matK擴增率91.4%，相較與其他條形碼，其通用性稍差。之前就有報道，matK基因雖然是葉綠體基因組編碼蛋白中進化最快的基因，但其引物通用性一直飽受爭議[22]。DNA條形碼的擴增性直接影響其應用范圍和效果。如果一個DNA條形碼其擴增性不強，通用性比較低，即使它的分辨率很高，也很難得到推廣和應用[23]。為了提高條形碼的通用性，一般選擇擴增效率高的引物，及更短的片段，即微型DNA條形碼，這種微型DNA條形碼更適合DNA受到降解或DNA難以提取樣品的鑒定[24]。

本研究對DNA條形碼序列測序、校正，計算遺傳分化距離，并利用Wilcoxon秩和檢驗和建立NJ樹等分析方法，評價它們對鐵皮石斛及其他石斛的分辨能力。雖然rbcL和trnH-psbA在植物類鑒別與分類中經常使用[25]，但在本實驗中，它們在鐵皮石斛種內的最大遺傳距離卻大于其他石斛種間的最小遺傳距離，不適合用于鐵皮石斛與其近緣石斛之間的鑒定。另外7 條DNA條形碼滿足種內最大遺傳距離小于種間最小遺傳距離的要求，初步判定可作為鑒定鐵皮石斛的候選條形碼。其中，nad1基因序列所含的變異位點少，進化速度慢，對本實驗中石斛材料的分辨率為36.3%。丁鴿等[17]利用nad1序列研究金釵石斛和其混合品親緣關系時，也發現該序列變異程度不高。進一步體現了植物線粒體基因進化速度慢的事實，在選擇此類基因作為DNA條形碼時更需要篩選和驗證。trnG-trnS片段序列在石斛屬中變異程度相對較大，但存在很多堿基的插入/缺失，過多的插入以及缺失不利于序列比對，導致鑒定準確率和效率低[20]。Ycf1b與psbK-psbI序列對于金釵石斛和鉤狀石斛的鑒定效果不理想，但這兩種石斛是市場上與鐵皮石斛混淆最為嚴重的親緣種[26]。ITS2和trnL-trnF序列對本研究中的石斛材料的分辨率最高，都達到了90.1%，但都還無法做到100%的分辨。這與丁小余等[14]利用ITS2進行石斛類鑒定成功率不同，可能由于所選取的材料數量與種類不同，鑒定結果計算也大不相同。李海霞[27]同樣基于ITS2序列分析了多種石斛屬種間鑒別，得出有部分石斛由于序列分析混亂，也無法做到利用ITS2均可成功鑒定。有關trnl-trnF序列片段進行石斛類鑒定的研究較少，邢文瑞[28]利用trnL-trnF序列片段構建NJ進化樹，得到石斛屬種間鑒定效果良好，但也無法滿足單一DNA條形碼鑒定。因此在利用DNA條形碼對植物材料進行鑒定或分類時，推薦多條DNA條形碼組合使用，從而提高分辨率。本實驗推薦ITS2+trnL-trnF序列作為鐵皮石斛及其近緣種鑒定的條形碼組合。ITS2序列片段位于核糖體DNA變異較大的基因轉錄間隔區，同時具有較高的拷貝數與較快的進化速率[29]。trnL-trnF基因片段位于葉綠體基因非編碼區的大單拷貝區，約為600～1 400 bp，因為進化速率較快，適合作為DNA條形碼[30]。一方面這兩個條形碼的分辨率高，另一方面，ITS2為核基因組條形碼，trnL-trnF為葉綠體條形碼，這兩個不同來源的基因片段可能在不同的類群中存在不同的分辨率，兩者的結合，則有效提高分辨率。ITS2+trnL-trnF的組合能對本實驗中所選的11 種石斛屬材料進行鑒定，然而我國石斛種類有70 多種，ITS2+trnL-trnF的組合是否適合更多石斛材料的鑒別，還需要進一步研究。

4 結 論

本研究比較分析了9 種常用植物DNA條形碼對11 種石斛屬材料的鑒別能力，9 種條形碼的擴增性及通用性良好，不同條形碼對所測試石斛屬材料的鑒別能力有差異，其中ITS2序列和trnL-trnF片段序列的鑒定能力最高，分辨率均達到90.1%。將ITS2序列和trnL-trnF序列相結合，對所用石斛屬材料達到了100%鑒定，推薦推薦使用ITS2+trnL-trnF組合作為鐵皮石斛資源鑒定的DNA條形碼。