戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發酵對獼猴桃酒香氣的影響

尹雪林，龔麗娟，鐘 武，李二虎

（華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

獼猴桃，又名奇異果、羊桃等，為獼猴桃科獼猴桃屬落葉藤本植物，獼猴桃果實富含VC、多種氨基酸和礦物質等，營養價值和藥用價值高，有“VC之王”的美譽[1]。獼猴桃是典型的呼吸躍變型水果，生理后熟過程明顯導致其不耐貯藏，皮薄汁多易受到機械損傷和微生物侵染而腐壞，因此將獼猴桃精深加工成高附加值產品能夠有效解決獼猴桃腐爛浪費的情況[1-2]。獼猴桃酒作為獼猴桃的一種精深加工產品，其風味獨特、營養成分高，但在實際生產過程中，由于獼猴桃的品種差異、發酵菌株的選擇、接種方式等原因，獼猴桃酒尚存在香氣稀薄、典型性欠佳等缺點[3-4]。為解決獼猴桃酒香氣稀薄的問題，有研究者提出利用非釀酒酵母和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合發酵改善獼猴桃酒的香氣品質[5]。有研究結果表明，相對于傳統的發酵方式，利用非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵對果酒的風味和口感發揮著積極作用[6-7]。Iris等[8]研究發現與純培養釀酒酵母發酵相比，非釀酒酵母和釀酒酵母混合接種會產生更多的二乙酰、乳酸乙酯和2-苯乙基乙酸酯等；Comitini等[9]研究表明，與單接種釀酒酵母相比，兩種酵母混合發酵降低了葡萄酒的揮發性酸度，同時提高了酒中2-苯基乙醇和多糖的含量。

非釀酒酵母是一類自然存在于漿果、果梗表面、果園土壤或釀酒環境中可參與果酒發酵的微生物，在發酵過程中會產生高級醇、酯類、萜類化合物、乙醛、乙酸等代謝產物，這些不同的代謝產物會影響果酒的香氣成分、酒體、風味和復雜性，進而影響果酒品質[10-13]。戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）是一種非常有發展潛力的非釀酒酵母，具有良好的釀酒特性，能產生低揮發性酸、乙酸乙酯、乙醛、乙偶姻等，對SO2有較高的抗性，能耐受16.5%乙醇，有較好的生物轉化萜的能力，以及增加某些芳香族化合物的產量等特性[14]。Azzolini等[15]研究表明戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母混合發酵提高了Narince葡萄酒的香氣強度和復雜性，緩和了葡萄酒的發酵速率，進一步提高了醇類和酯類的含量。原苗苗等[16]研究發現戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發酵可以增強葡萄酒的發酵香氣，使酒中乙基酯類物質含量明顯增加，提高酒的香氣復雜性。戴爾有孢圓酵母在高糖環境中能夠產生較低含量的乙酸，可以耐受獼猴桃原汁或者額外添加糖所產生的高糖環境[17-18]。

戴爾有孢圓酵母作為非釀酒酵母，與釀酒酵母混合培養應用于獼猴桃酒的釀造還鮮有報道，因此本實驗將戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母混合接種于獼猴桃汁中進行發酵，探究混菌發酵對獼猴桃酒香氣的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

釀酒酵母RV002、戴爾有孢圓酵母SY-2-2 安琪酵母股份有限公司；獼猴桃 秦品源農業發展有限公司。

果膠酶、L-蘋果酸（化學純）、檸檬酸（99.995%）、DL-酒石酸（≥99.999 5%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇（≥99.9%）、偏重亞硫酸鉀、草酸、磷酸、碳酸氫鈉、2,6-二氯靛酚、重鉻酸鉀、碘化鉀、L(+)-抗壞血酸標準品（均為分析純），3,5-二硝基水楊酸（化學純） 國藥集團化學試劑有限公司；香氣物質標準品 美國Sigma公司；白砂糖市售；其他試劑均為分析純。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基 北京酷來搏科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

WL（wallerstein laboratory nurtrient agar）培養基：酵母浸粉4 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，瓊脂20 g/L，儲液A 40 mL/L，儲液B 1 mL/L，儲液C 1 mL/L，121 ℃滅菌20 min。

儲液A：1.25 g氯化鈣、1.25 g硫酸鎂、4.25 g氯化鉀、5.5 g磷酸二氫鉀，定容至400 mL，121 ℃滅菌20 min后4 ℃保存；使用時按照40 mL/L加入。

儲液B：0.25 g氯化鐵、0.25 g磷酸錳，定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min后置于4 ℃的冰箱中保存；使用時按照1 mL/L加入。

儲液C：0.44 g溴鉀酚綠溶于10 mL無菌水和10 mL 95%乙醇溶液中；使用時按1 mL/L加入。

1.2 儀器與設備

SPX-250B生化培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；TGL-16g離心機 飛鴿儀器有限公司；UV-1700紫外-可見分光光度計 日本島津公司；e2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國Waters公司；6890N/5975B氣相色譜-質譜聯用儀美國Agilent公司；HH-S型恒溫水浴鍋 上海合恒儀器設備有限公司；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃酒發酵工藝流程

1.3.2 操作要點

原料處理：挑選成熟良好的新鮮獼猴桃，洗凈晾干去皮后，放到已滅菌的榨汁機中破碎打漿，稱質量，記錄。

果漿處理：按60 mg/kg在果漿中加入偏重亞硫酸鉀；按150 mg/L的添加量加入果膠酶，40 ℃恒溫水浴酶解1.5 h，4 層紗布過濾取得獼猴桃汁。

成分調整：為了方便獼猴桃酒的存放，將目標酒度設為11%（V/V），發酵前在獼猴桃汁中添加適量的白砂糖使其可溶性固形物含量達到20 °Brix以上[19-20]。

滅菌：按300 mL/瓶的量將獼猴桃汁分裝，以65 ℃恒溫水浴30 min。水浴滅菌后，將發酵瓶置于無菌操作臺紫外殺菌，冷卻至常溫后接菌發酵。

主發酵：釀酒酵母接種量為1%（0.7×106CFU/mL），戴爾有孢圓酵母接種量為2%（1.8×106CFU/mL），按以下4 種方式接種：A為單接種釀酒酵母；B為同時接種戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母；C為順序接種戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母：先接種戴爾有孢圓酵母發酵48 h后，再接種釀酒酵母；D為單接種戴爾有孢圓酵母；每種接種方式設置3 個重復。將4 組發酵瓶置于25 ℃恒溫培養箱中靜置發酵6～8 d，待糖質量濃度降至10 g/L后結束主發酵。

后發酵：將倒罐后的酒樣置于18 ℃恒溫培養箱中靜置發酵10 d左右結束后發酵。將后發酵結束后的酒樣通過4 層紗布過濾并沉淀，取上清液貯存于-20 ℃冰箱待用。

1.3.3 菌種活化與保存

取2 株酵母菌凍存液（50%甘油保存）各1 管于YEPD培養基中，于28 ℃、120 r/min條件下培養24 h后，在PDA固體培養基上進行劃線分離，并于28 ℃培養2 d。在PDA固體培養基上挑取菌落特征明顯的菌株接種于YEPD液體培養基中，于28 ℃、120 r/min條件下培養24 h制成種子液。取已活化的酵母種子液各1 mL于滅菌的凍存管內，再各加入1 mL已滅菌的50%甘油，混勻后置于-20 ℃冰箱內保存。

1.3.4 酵母計數

釀酒酵母用YEPD固體培養基計數，戴爾有孢圓酵母用WL培養基計數。

1.3.5 香氣成分的測定

1.3.5.1 香氣成分的檢測

采用頂空固相微萃取進行香氣成分的富集[21]，然后對其進行檢測，方法如下：采用6890N型氣相色譜儀，色譜柱：HP-5MS彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，后以3 ℃/min的速率升溫至120 ℃，再以8 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持10 min；分流方式：不分流；載氣：He，流速：1.0 mL/min。5975B質譜條件：接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子化方式電子電離，電子能量70 eV，質量掃描范圍50～550 u。

1.3.5.2 香氣成分的定性與定量

定性：通過檢測得到的質譜數據與NIST 05質譜庫進行對比定性，實驗結果保留Qual＞70的鑒定結果。定量：采用內標法進行定量，選用環己酮作為內標物質。計算公式如下：

1.3.6 理化指標的測定

可溶性固形物含量：采用自動阿貝折射儀測定；澄清度：采用分光光度計法測定，即發酵液在分光光度計波長680 nm下的透光率；揮發性酸含量：采用乙酸酶聯免疫反應試劑盒方法測定；pH值：采用pH計測定；乙醇體積分數：采用重鉻酸鉀氧化法測定[22]；總酸含量：采用酸堿滴定法測定；還原糖含量：采用3,5-二硝酸水楊酸法測定[23]；總酚含量：采用Folin-Ciocalte比色法測定[24]；VC含量：采用2,6-二氯靛酚滴定法測定。

1.3.7 獼猴桃酒樣香氣感官分析

獼猴桃酒評分標準參照李華敏等[25]的方法并稍作修改，評價小組由10 名感官評價人員組成，包括5 男5 女，年齡24～27 歲，獼猴桃酒香氣描述詞匯為果香、花香、酒香、草本香、甜香和整體香氣強度[25-26]，評分選取10點制（0為沒氣味，9為氣味最強）：0～3低強度，3～6中等強度，6～9高強度。

1.4 數據統計與分析

使用SPSS 23.0軟件進行統計分析，利用方差分析（analysis of variance，ANOVA）、最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進行差異顯著性檢驗和多重比較，P＜0.01，差異極顯著；P＜0.05，差異顯著。使用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃汁中酵母活菌數動態變化及理化指標

2.1.1 不同接種方式下活菌數變化

4 組獼猴桃酒在發酵初期，戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母均能適應發酵環境并快速增長。圖1中，發酵第2天戴爾有孢圓酵母活菌數達到峰值（9×106CFU/mL）后急速減少，說明其生長受到阻礙，4 d后又緩慢增加；發酵第4天釀酒酵母活菌數最大（3×107CFU/mL），之后數量緩慢減少并趨于穩定。圖2中，接種釀酒酵母后，戴爾有孢圓酵母的生長受到一定程度的抑制，活菌數下降，第4天活菌數達到最高值（6×107CFU/mL）；釀酒酵母的生長也受到抑制，第6天活菌數達到峰值（3×106CFU/mL）。圖3中，單獨發酵組的釀酒酵母和戴爾有孢圓酵母表現出較強的發酵動力，第4天活菌數達到峰值，分別為5×107、8×107CFU/mL。結果表明，戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母混合發酵前期均能正常生長，后期生長會受到一定程度的抑制，抑制原因可能是由于激烈的營養競爭或是細胞-細胞接觸介導機制使活菌死亡。也有研究報道混菌發酵過程中酵母生長受到抑制的現象[27-28]。本實驗采用先接種戴爾有孢圓酵母再接種釀酒酵母的順序接種發酵方式，因為一般非釀酒酵母菌株生長繁殖的速率比釀酒酵母慢，前期預實驗結果和其他研究數據表明，先接種戴爾有孢圓酵母48 h后活菌數達到一定的量，對葡萄酒的香氣和品質有積極貢獻[29-30]。本實驗同時接種發酵組的戴爾有孢圓酵母在第4天活菌數開始增多，可能是由于戴爾有孢圓酵母分泌了某些針對釀酒酵母的代謝產物或毒素，導致釀酒酵母的生長受到抑制，戴爾有孢圓酵母開始生長[31]。

圖1 同時接種方式下戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母活菌數動態變化Fig.1 Dynamic changes in the viable count of T.delbrueckii and S.cerevisiae in simultaneous inoculation

圖2 順序接種方式下戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母活菌數動態變化Fig.2 Dynamic changes in the viable count of T.delbrueckii and S.cerevisiae in sequential inoculation

圖3 單接種戴爾有孢圓酵母、釀酒酵母的活菌數動態變化Fig.3 Dynamic changes in the viable count of T.delbrueckii and S.cerevisiae in single inoculation

2.1.2 獼猴桃酒的理化指標

獼猴桃酒的理化指標見表1。混菌發酵組與單接種釀酒酵母組相比，乙醇體積分數、總酸含量和pH值差異最顯著。總酚質量濃度在0.56～0.76 g/L之間，揮發性酸質量濃度為0.2～0.37 g/L，在各個獼猴桃酒之間存在一定差異。本實驗的順序接種發酵組產乙醇低于單接種釀酒酵母組，這與前人的研究結果一致[32]。有研究發現戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發酵會增加果酒的香氣復雜性，降低乙酸的產量[33-34]，但本實驗卻并未發現混菌發酵組的乙酸量顯著降低，可能與發酵水果種類有關，也可能與所用戴爾有孢圓酵母菌株有關。

表1 獼猴桃酒理化指標Table 1 Physicochemical indexes of kiwifruit wine

2.2 獼猴桃酒揮發性成分分析

2.2.1 不同接種方式所得獼猴桃酒的揮發性成分

由表2可知，單接種釀酒酵母組測得16 種揮發性成分，總質量濃度為312.18 mg/L；同時接種發酵組測得20 種揮發性成分，總質量濃度為282.17 mg/L；順序接種發酵組測得23 種揮發性成分，總質量濃度為336.95 mg/L；單接種戴爾有孢圓酵母組測得14 種揮發性成分，總質量濃度為315.81 mg/L。單接種釀酒酵母組和同時接種發酵組的揮發性成分均以酯類為主，含量較多的是癸酸乙酯、辛酸乙酯、十二酸乙酯等，賦予獼猴桃酒濃郁的花果香。順序接種發酵組和單接種戴爾有孢圓酵母組的揮發性成分以醇類為主，含量較高的是苯乙醇。順序接種發酵組中萜烯類物質含量最高，特有β-大馬士酮、松油烯、香茅醇、2-乙基己醇、苯甲醇、α-松油醇、4-乙烯基愈創木酚、2,4-二叔丁基酚。

表2 獼猴桃酒的各種揮發性成分質量濃度Table 2 Volatile compound concentrations in kiwifruit wine mg/L

酵母種類不同產生的生理活性及代謝過程不同，對香氣成分的影響也不同[16]。與單接種發酵組相比，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發酵能夠提升獼猴桃酒香氣成分的種類和含量，增強獼猴桃酒的香氣特征，這與Eollero等[35]的研究結果一致。有研究發現戴爾有孢圓酵母產辛酸乙酯的能力較強[36]，但本實驗中辛酸乙酯的含量較低，可能是釀酒酵母抑制了戴爾有孢圓酵母的產酯能力，也有可能是使用的戴爾有孢圓酵母菌株不同。順序接種發酵組和單接種戴爾有孢圓酵母發酵組中苯乙醇含量較高，可能與戴爾有孢圓酵母中β-葡萄糖苷酶的活性有關，也可能是酵母中β-葡萄糖苷酶的活性與L-苯丙氨酸的代謝共同作用的結果[16]。祝霞等[37]研究發現，戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母順序接種發酵的酒樣中萜類、醇類等化合物明顯增加，提高了酒體的香氣復雜性和層次感，本研究順序接種發酵組萜烯類化合物的含量最大。Romano等[38]研究表明順序接種發酵葡萄酒與同時接種發酵葡萄酒在香氣成分上有很大差別，前者的香氣成分更加復雜。本研究同時接種發酵組和順序接種發酵組雖然都提高了獼猴桃酒香氣物質的含量，但兩者也有差異。同時接種發酵組更多地提高了十二酸乙酯、癸酸異戊酯、十四酸乙酯和十六酸乙酯含量，順序接種發酵組更多地促進了苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、桉樹油醇、芳樟醇、苯乙醇、β-大馬士酮、松油烯的生成，而且順序接種發酵組的香氣成分種類和總含量最高。

2.2.2 主要揮發性成分氣味活性值（odor activity value，OAV）分析

揮發性物質對酒樣香氣感官的貢獻率通常用OAV表示，當香氣質量濃度大于感覺閾值（OAV＞1）時，這種香氣可以被人類的嗅覺感知；當香氣質量濃度小于感覺閾值（OAV＜1）時，雖不能被人類直接感知，但對酒樣整體香氣有一定的調節作用。獼猴桃酒OAV分析結果如表3所示。酯是通過醇和酸的酯化反應生成，乙醇發酵過程中產生的酯類物質可賦予果酒獨特的花果香[44]。單接種釀酒酵母發酵組和同時接種發酵組OAV較高的是辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯，這些酯類化合物具有典型的水果香氣，如菠蘿、梨、椰子等[39]，因而能賦予獼猴桃酒濃郁的果香味。醇類化合物既是芳香物質又是呈味物質，還能襯托酯香，適宜濃度的醇類物質可以增加香氣的協調性[45]。順序接種發酵組OAV大于1的香氣成分較多，主要是β-大馬士酮、乙酸苯乙酯、芳樟醇、苯乙醇等，這些揮發性物質主要呈現玫瑰、鈴蘭等花香[39,41]，能賦予獼猴桃酒獨特的花香。順序接種發酵組特有的松油烯、2,4-二叔丁基酚、苯甲醇、芳樟醇、香茅醇等能賦予獼猴桃酒清甜的果香和濃郁的花香。為了更直觀地看出各香氣OAV的差異，對OAV大于1的香氣化合物進行熱圖統計分析（圖4）。與同時接種發酵組相比，順序接種發酵組不僅含有較多OAV大于1的酯類香氣成分，也含有許多能被嗅覺感知到的醇類、酚類、萜烯類化合物，由此推測順序接種發酵組的獼猴桃酒香氣特征更加豐富。由氣味活度值結果可推測順序接種發酵組的花果香味更濃郁，香氣層次更豐富，但實際結果要根據感官分析進一步驗證。

表3 獼猴桃酒中OAV大于1的芳香化合物及其氣味特征Table 3 Mean values of OAV and aroma characteristics of volatile compounds with OAV > 1 in kiwifruit wine

圖4 OAV大于1的揮發性香氣成分熱圖Fig.4 Heat map of volatile aroma components with OAV > 1 in kiwifruit wine

2.2.3 OAV疊加香氣分析

本實驗將具有相似氣味描述的揮發性物質的OAV（OAV＞1）疊加，建立芳香系列，用來表明戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發酵對獼猴桃酒香氣特征的影響以及不同香氣成分對獼猴桃酒嗅覺感官的影響。根據已有研究[39-43]，這些揮發性化合物的香氣與“菠蘿”“柑橘”“玫瑰”“蜂蜜”“草藥”“蠟味”和“脂肪酸”相關，最終獲得5 種芳香系列的揮發性化合物，包括果香、花香、甜香、草本香、脂肪香。由圖5可知，單接種釀酒酵母組的果香系列香氣最大；順序接種發酵組花香、甜香、草本香系列香氣最高，一方面是由于產生了較多的苯乙醇、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯，另一方面，雖然桉樹油醇、β-大馬士酮、芳樟醇、苯甲醇的質量濃度低，但它們對應的閾值偏低，所以花香、甜香、草本香明顯。

圖5 OAV疊加香氣分析圖Fig.5 Superimposed OAVs of aroma components

2.3 獼猴桃酒香氣感官分析

由圖6可知，單接種釀酒酵母組的果香、酒香最濃郁，花香、甜香味最低，草本香處于中等強度，整體香氣評分第2。同時接種發酵組擁有中等強度的果香、花香、酒香、甜香，草本香味最低，整體香氣評價中等偏低。順序接種發酵組的花香、草本香、甜香最濃郁，果香、酒香處于中等水平，整體香氣評分最高。單接種戴爾有孢圓酵母發酵組具有中等強度的果香、花香、草本香、甜香，酒香和整體香氣評分最低。感官品評結果與本實驗的揮發性成分測定結果基本相符，順序接種發酵組的呈香物質β-大馬士酮、乙酸苯乙酯、芳樟醇、苯乙醇等夠能賦予獼猴桃酒獨特的花香，特有的呈香物質松油烯、2,4-二叔丁基酚、苯甲醇、芳樟醇、香茅醇等能賦予獼猴桃酒清甜的果香和花香。

圖6 獼猴桃酒香氣品評結果Fig.6 Sensory evaluation of aroma characteristics of kiwifruit wine

3 結 論

為確定釀酒酵母和戴爾有孢圓酵母混合發酵對獼猴桃酒風味的影響，本實驗以單接種釀酒酵母、單接種戴爾有孢圓酵母為對照組，同時接種戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母、順序接種戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母為實驗組進行獼猴桃酒發酵實驗。結果表明，混菌發酵組產生的香氣成分種類高于單菌發酵組，且順序接種發酵組的揮發性成分種類（23 種）和總質量濃度（336.95 mg/L）均最大。混菌發酵組與單接種釀酒酵母組相比，順序接種發酵組的乙醇體積分數、揮發性酸、總酸含量最低。戴爾有孢圓酵母的參與提高了順序接種發酵組中揮發性物質含量和種類，特別是苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、苯乙醇、β-大馬士酮、α-松油醇、桉樹油醇等物質，賦予獼猴桃酒濃郁的花果香味并豐富了獼猴桃酒的香氣成分。香氣感官分析表明順序接種發酵組的花香、草本香、甜香味更加濃郁，酒香和果香次之，整體評分最高。綜上所述，戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母順序接種發酵產生的獼猴桃酒香氣更豐富，對改善獼猴桃酒的香氣品質有積極作用。因此，本研究探究戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發酵對獼猴桃酒香氣品質的影響，為解決獼猴桃酒香氣稀薄的問題以及非釀酒酵母在獼猴桃酒的生產應用提供理論依據。