基于GC-IMS和化學計量學分析海鱸魚肉蒸制過程中風味物質的變化

徐永霞，白旭婷，馮 媛，趙洪雷,*，李學鵬，勵建榮，儀淑敏,*，謝 晶，郭曉華

（1.渤海大學食品科學與工程學院，渤海大學實驗中心，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 錦州 121013；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.山東美佳集團有限公司，山東 日照 276815）

海鱸魚（Perca fluviatilis）學名為日本真鱸，屬鱸形目，花鱸屬，是我國沿海地區重要的經濟魚類之一[1]。海鱸魚主要分布于太平洋西部，在我國以黃海和渤海產量居多[2]。海鱸魚年產量大，據中國漁業年鑒最新統計，2019年我國鱸魚養殖年產量約18萬 t，比2018年增長了8.16%[3]。海鱸魚的肉質細嫩鮮美，富含蛋白質和不飽和脂肪酸，且鈣、鎂、鋅、硒、VA和B族維生素含量豐富，在市場上深受消費者的青睞[4]。

熱處理是肉制品加工的重要方式，不僅可以提高食用安全性，而且可以賦予制品良好的風味和色澤[5]。熱處理的方式和條件對肉品品質具有重要影響。常見的食品熱處理方式包括蒸、煮、油炸和微波等，其中蒸制被認為是最健康的熱加工方式，不僅可以較好地保留食材的營養成分和原有的風味特性，而且減少了油脂和鹽的攝入，更符合現代人們的健康飲食需求[6]。隨著生活水平的提高，人們對水產品的要求不再局限于營養價值，也越來越注重其風味品質[7-8]。目前，關于魚肉揮發性風味物質的研究主要采用氣相色譜-質譜聯用法、全二維氣相色譜-飛行時間質譜法、氣相色譜-嗅聞法、電子鼻技術等[9-10]。氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）技術是近年來新興的一種快速檢測揮發性風味物質的先進技術，能同時獲得風味物質的構成及樣品品質判別信息，具有靈敏度高、檢測速度快、操作方便且樣品分析溫度低等特點，更能真實反映樣品的風味存在狀態[11]。此外，GC-IMS可對揮發性風味物質進行可視化表征，從而實現對不同樣品的區分。目前GC-IMS技術已廣泛應用于肉類、果蔬和酒類等食品中，在水產品中的應用相對較少，應用領域主要集中在關鍵香氣[12]和異味化合物[13]的鑒定，食品的分級、溯源、品質評價[14-15]和質量控制[16]等方面。GC-IMS技術在食品風味領域中的研究逐漸增多，同時結合化學計量學方法也為該技術在食品風味分析中的應用提供了重要貢獻。

本實驗以海鱸魚為研究對象，采用GC-IMS技術結合正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）、模型驗證及熱圖分析等化學計量學方法，研究不同蒸制時間對海鱸魚肉揮發性風味物質的影響，旨在為海鱸魚的精深加工及食品化菜品的開發提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮海鱸魚，每尾長（20±5）cm，尾質量約1 kg，購于遼寧錦州市林西街水產市場。

2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PL602-L電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；FlavourSpec?風味分析儀（配有LAV（Laboratory Analytical Viewer）分析軟件和GC×IMS Library Search定性軟件） 德國G.A.S公司；Checkmate3頂空分析儀丹麥Densensor公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

取海鱸魚背部肌肉，洗凈瀝干后切成大小均勻的魚塊，然后置于蒸鍋內分別加熱4、6、8、10 min和12 min，取出吸去魚肉表面水分得到不同的蒸制樣品（Z4、Z6、Z8、Z10和Z12）。以未經處理的新鮮魚肉塊為對照組（Z0）。

1.3.2 GC-IMS測定

自動進樣條件：準確稱取2.0 g樣品置于20 mL頂空瓶中，設置孵育溫度60 ℃，孵化轉數500 r/min，孵育時間15 min，采用頂空自動進樣的方式，進樣量500 μL，進樣針溫度65 ℃，不分流模式進樣。

GC條件：采用石英毛細管色譜柱FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm，1 μm），柱溫60 ℃，載氣為氮氣（≥99.999%），載氣的流速程序見表1，遷移管溫度45 ℃，分析時間30 min，載氣/漂移氣為N2。

表1 GC檢測條件Table 1 Gas chromatographic conditions

1.4 數據分析

采用Origin 2019b軟件、SPSS 19.0軟件進行數據處理及顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。魚肉樣品中的揮發性成分采用儀器配套的LAV（Laboratory Analytical Viewer）軟件和Library Search軟件進行采集和分析。利用LAV分析譜圖并進行定量分析；通過Reporter和Gallery Plot插件對比指紋圖譜的差異；利用Dynamic PCA插件對樣品進行聚類分析，以確定未知樣品的種類；應用Library Search軟件內置的NIST和IMS數據庫對揮發物進行定性分析。

2 結果與分析

2.1 海鱸魚肉風味物質的定性分析

如圖1所示，圖中遷移時間1.0 ms處紅色豎線表示反應離子峰（reactive ion peak，RIP），每個樣品的遷移時間約為2.08 ms，各種風味物質的保留時間集中分布在100～380 s之間。RIP峰兩側的每個點反映了離子流的信號強度，代表一種揮發性物質，點的顏色及面積表示物質含量的大小，點的顏色越深、面積越大反映離子流的信號越強，物質濃度越高，反之越低[17]。從圖1可直觀看出，樣品經蒸制處理后揮發性物質組成的差異，圖中淺藍色點和紅色點的數量明顯增加，且紅色點的顏色逐漸加深，說明蒸制后樣品的風味物質含量明顯高于未經蒸制處理的樣品。

圖1 海鱸魚肉蒸制過程中的特征風味二維GC-IMS譜圖Fig.1 Two-dimensional GC-IMS spectra of characteristic flavor components in sea bass flesh during steaming process

為了進一步分析蒸制過程中海鱸魚肉揮發性風味物質的變化，采用GC×IMS Library Search軟件內置的NIST數據庫和IMS數據庫進行定性分析。依據揮發性物質的GC保留時間和離子遷移時間，以C4～C9的正酮類作為外標物計算每種揮發性物質的保留指數，通過與GCIMS數據庫進行匹配，完成對魚肉中揮發性物質的定性分析[18]。如表2所示，海鱸魚蒸制過程中可明確定性的揮發性物質共有43 種，包括提高待分析物濃度時，出現2 個分子時共用一個質子或電子，形成二聚體的現象[19]。鑒定出的揮發性物質碳鏈普遍集中在C3～C9之間，包括醛類12 種、醇類8 種、酮類5 種、酸類2 種、酯類2 種和含硫化合物1 種，其中醛類物質的含量最高，其次是酮類和醇類物質。

表2 海鱸魚肉蒸制過程中鑒定出的揮發性物質Table 2 Volatile compounds identified in sea bass flesh during steaming process

2.2 不同蒸制時間下海鱸魚肉的風味變化

利用GC-IMS分析海鱸魚肉蒸制過程中揮發性風味物質的變化，得到的風味指紋圖譜如圖2所示。指紋圖譜中代表揮發性物質的點亮度發生明顯變化，說明不同蒸制時間下魚肉中揮發性風味物質的組成存在明顯差異。經蒸制處理后，魚肉樣品中風味物質的含量明顯高于對照組。隨著蒸制時間的延長，魚肉中揮發性風味物質的種類和濃度總體有不同程度的上升，這可能與魚肉蒸制過程中發生的美拉德反應、脂類的氧化和裂解有關，此外一定的熱處理可促進魚肉中揮發性風味化合物的釋放，從而增加魚肉中揮發性物質的含量[20]。榮建華等[21]通過固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法分析蒸制對脆肉鯇魚肉揮發性成分的影響，發現蒸制后魚肉中揮發性物質的相對含量及種類均高于生魚肉。

圖2 海鱸魚肉蒸制過程中的Gallery Plot圖Fig.2 Gallery Plot analysis of volatile flavor compounds in sea bass flesh during steaming process

由圖3可知，醛類物質在海鱸魚肉中相對含量最高，其次是酮類和醇類物質。據研究報道，醛類化合物（C6～C9）主要來源于不飽和脂肪酸的氧化降解或氨基酸的斯特勒克降解反應，其氣味閾值比較低，對魚肉的整體風味影響較大[22-23]。和生魚肉相比，蒸制處理顯著增加了魚肉中醛類物質的含量，且隨著蒸制時間的延長，魚肉中的己醛、庚醛、辛醛、壬醛、3-甲基丁醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛和苯甲醛等醛類物質的含量逐漸增加。己醛和庚醛主要產生于亞油酸和花生四烯酸的氧化，辛醛和壬醛主要由油酸的氧化形成[24]；烯醛類主要來源于亞油酸和亞麻酸的降解[25]。其中己醛有青草氣味，(E)-2-庚烯醛具有油脂香，對魚肉風味均有重要貢獻。酮類和醇類物質一般來源于脂肪酸的氧化降解，其氣味閾值通常高于醛類，但具有獨特的花香、水果香等令人愉悅的風味，可能對特殊魚香味的形成有一定貢獻。隨著蒸制時間的延長，魚肉中的1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-己醇、1-戊醇、1-丁醇、糠醇、3-呋喃甲醇、2-庚酮、2-戊酮和2-丁酮等醇類和酮類物質含量逐漸增加。1-辛烯-3-醇主要由亞油酸的氧化產生，具有典型的蘑菇味和清香，可增強魚肉的脂香味[23]。酮類物質如2-庚酮、2-丁酮可通過脂肪氧化和美拉德反應產生，有研究報道，酮類對消減腥味有一定的貢獻[25]。還有少部分物質在蒸制4 min或6 min時含量較高，如戊醛、丁醛和乙酸乙酯等。3-甲基丁醇、二甲基二硫、丙酸等物質在生魚肉中檢出的含量較高，而蒸制后含量逐漸降低。二甲基二硫化合物主要是由魚體內含硫氨基酸降解產生，其氣味閾值極低，在高濃度時具有刺激性氣味，通常與變質的海味有關[26]。3-甲基丁醇和丙酸具有令人不愉快的氣味，其在蒸制樣品中的相對含量顯著降低，說明蒸制處理可明顯改善魚肉的風味。

圖3 海鱸魚肉蒸制過程中揮發性組分的相對含量變化Fig.3 Changes in contents of volatile components in sea bass flesh during steaming process

2.3 OPLS-DA及熱圖聚類分析

2.3.1 樣品的OPLS-DA

OPLS-DA為能夠去除與X軸、Y軸有關的信號，建立物質表達量與樣品類別間關系模型的有效判別分析統計方法[27]。利用OPLS-DA中的得分散點圖對不同蒸制時間下魚肉樣品中的風味物質進行分析，結果如圖4所示。隨機改變分類變量的排列順序建立相應的模型，RX2=0.966，RY2=0.879，當R2和Q2處于0.5～1之間時，表明模型有較好的概括解釋率[28]：Q2=0.714，表示模型有較好的預測能力。當模型的穩定性和預測能力都比較好時，說明構建的模型穩定性及預測能力均達到要求，可用于區分不同蒸制時間下海鱸魚肉揮發性風味組成的差異。

圖4 海鱸魚肉蒸制過程中的OPLS-DAFig.4 OPLS-DA plot of sea bass flesh samples with different steaming times

2.3.2 模型驗證

利用置換檢驗對OPLS-DA模型進行驗證，根據樣本數據的隨機排列情況進行統計學推斷[29]。它將樣本進行順序上的置換（n=200），重新得出統計檢驗量，構造經驗分布，以此為基礎進行推斷。Q2代表累計交叉有效性，其值與模型預測能力呈正比；R2代表累計方差值，表示有多少原始數據被用來建立新的OPLS-DA模型，其值大則表示模型的解釋能力強[30]。應用OPLS-DA模型進行擬合，其評價指標為RX2=0.966，RY2=0.879，Q2=0.714，說明所建模型擬合效果良好。為進一步驗證模型是否過擬合，將部分樣本的類別打亂，進行200 次的置換擬合。如圖5所示，R2與縱軸相交（0，0.299），Q2與縱軸相交（0，-0.849），R2和Q2兩條回歸線斜率相對較大，左邊隨機排列產生的實驗值R2和Q2均低于最右邊的R2和Q2值，且Q2回歸線的截距是負數，說明OPLS-DA模型均無擬合現象，預測能力很好，可直接用于樣品的判別分析。

圖5 海鱸魚肉蒸制過程中OPLS-DA的擬合曲線Fig.5 Fitting curve of OPLS-DA for sea bass flesh samples with different steaming times

2.3.3 熱圖分析

通過熱圖和凝聚層級聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）法，將不同蒸制時間下的魚肉樣品與43 種揮發性化合物的關系進行可視化。依據OPLS-DA模型中的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）將每個變量對分類的貢獻進行量化，其中VIP值大于1的揮發性化合物可作為潛在的特征標志物[31]。海鱸魚肉蒸制過程中共篩選出11 種特征揮發性標志物（VIP＞1），包括醇類5 種、醛類4 種、酯類2 種。為了更加直接地區分不同蒸制處理下魚肉特征揮發性化合物的變化，依據每種風味物質的峰強度值繪制熱圖，結果如圖6所示。通過熱圖并結合HCA可以區分不同蒸制時間下海鱸魚肉樣品的風味差異，可將具有不同風味特征的魚肉大致分為3 類，分別為生魚肉（Z0）、蒸制4、6、8 min和10 min的魚肉（Z4、Z6、Z8和Z10）以及蒸制12 min的魚肉（Z12）。生魚肉中揮發性標志物的種類較少，其中3-甲基丁醇在生魚肉中含量最高，其含量隨蒸制時間的延長而降低。Edirisinghe等[32]發現生魚中的異戊醇含量隨貯藏時間的延長而增加。因此，3-甲基丁醇可作為生魚肉的特征性風味物質。蒸制12 min的魚肉中1-庚醇、糠醇和(E)-2-庚烯醛的含量最高，這3 種風味物質可作為魚肉熟制后的特征性風味物質。

圖6 海鱸魚肉蒸制過程中特征風味物質的熱圖和HCAFig.6 Heatmap and HCA of characteristic flavor components in sea bass flesh samples with different steaming times

3 結 論

本研究采用GC-IMS技術對海鱸魚肉蒸制過程中揮發性風味物質的變化進行分析，共鑒定出43 種揮發性物質，包括醛類、酮類、醇類、酸類、酯類和含硫化合物，其中醛類物質的相對含量最高，其次是酮類和醇類物質。不同蒸制時間下海鱸魚肉的風味物質組成存在明顯差異，其中新鮮海鱸魚肉中3-甲基丁醇、二甲基二硫和丙酸等風味物質的相對含量較高，隨蒸制時間延長，魚肉中醛類、酮類和醇類物質的含量逐漸增加，如庚醛、辛醛、壬醛、3-甲基丁醛、(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛、苯甲醛、2-庚酮、2-丁酮、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-丁醇和3-呋喃甲醇等。采用OPLS-DA、熱圖聚類分析等計量學方法篩選出11 種揮發性標志物（VIP＞1），并能較好區分不同蒸制時間下的海鱸魚肉樣品，其中3-甲基丁醇、1-庚醇、糠醇和(E)-2-庚烯醛可作為生熟海鱸魚肉的特征標志物。