細胞外基質水凝膠協助干細胞移植治療的優勢及不足分析

董鴻斐，王 冰，黃 茜，原小惠，孫紅玉，湯禮軍

自1980年發現成體干細胞的可塑性后，大量研究表明干細胞在促進組織、器官愈合與再生中發揮重要作用[1-2]。為此，人們追求研究各類干細胞，主要包括間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、神 經 干 細 胞(neural stem cells，NSCs)和多能 干細胞（pluripotent stem cells，PSCs）[3]。目前，基于干細胞的療法已在骨骼重塑、心肌損傷、帕金森病、糖尿病和眼底病變等多個疾病中研究報道，并普遍被認為是安全、有效的[4-6]。盡管干細胞在組織修復、功能重建和器官再造等方面極具潛力，但干細胞治療還存在若干不足。通過將細胞外基質（extracellular matrix，ECM）制備成細胞外基質水凝膠（extracellular matrix hydrogel，ECMH），為克服干細胞移植治療中的不足帶來了希望。在此，筆者主要探討ECMH在干細胞移植治療中的優勢和不足。

1 ECMH應用于干細胞移植治療的原因

近年來，隨著對干細胞移植治療的研究不斷加深，也暴露出干細胞移植治療中存在的若干問題。首先，在大多數臨床試驗中，干細胞多在無任何載體的情況下通過注射器或者導管被注射到組織中，導致干細胞在注射過程中泄露及損傷的發生率較高；其次，不論干細胞移植方案如何變化，通常移植后只有少于5%的干細胞在注射部位持續存在并發揮治療作用[7]；最后，干細胞在機體內處于不同的細胞微環境中，適宜的干細胞微環境有助于保持干細胞的數量并具有調控干細胞的分化成熟的作用[8-9]，但是干細胞移植部位的微環境卻常因炎癥、創傷和氧化應激等因素影響變得惡劣，不利于干細胞存活及增殖分化，降低干細胞的治療效果。為改善干細胞移植過程中存在的問題，研究人員在組織工程上進行了多方面嘗試，發現水凝膠可以有效改善干細胞治療中的不足。水凝膠是含水量高的高分子多聚鏈化合物材料，多聚鏈通過物理和化學的交聯作用保持結構的完整性，從天然材料（如纖維蛋白、海藻酸鈉等）到合成材料（如聚乙二醇或聚丙烯酸等）均可制備成水凝膠[10]。在聯合干細胞治療中，水凝膠通過其可構建類似細胞外基質的特性，為干細胞提供適宜的微環境，從而提高干細胞移植治療效果。Moxon等[11]在生理條件下通過物理混合受控凝膠化將膠原蛋白原纖維摻入藻酸鹽水凝膠中，再將人誘導多能干細胞 （induced pluripotent stem cells,iPSC）衍生神經元封裝在混合水凝膠內，發現水凝膠中包封的神經元形成了復雜的神經網絡，并成熟為可表達突觸素的分支神經元。還有大量研究都證明通過構建類似細胞外基質環境可以有效提高干細胞的增殖及分化[12-13]。但在人體內，不同組織的細胞外微環境各有差異，傳統的水凝膠制備由于其結構單一及細胞間信號傳導的阻斷，嚴重的限制了水凝膠與干細胞復合體在臨床中的應用。將為不同組織提供微環境的ECM制備成ECMH，可解決的傳統水凝膠的缺點。與傳統的水凝膠相比，由于ECMH保留了原有組織內的膠原蛋白、透明質酸、糖胺聚糖和彈性蛋白等，因此具有以下優點：（1）可構成復雜的網架結構；（2）支持并連接組織結構；（3）調節組織與細胞的相互作用。因此，ECMH有望取代傳統水凝膠，并廣泛應用于干細胞移植治療。

2 ECMH在干細胞移植中的優勢

2.1 為干細胞提供適宜的細胞微環境 干細胞微環境是動態而復雜的，可以通過不同的時間節點和空間結構來共同影響干細胞的表型及特征。而為干細胞提供微環境的基礎便是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）。ECM的生化成分、力學特征及微管結構，都具有調節干細胞行為的能力，通過對ECM成分的調節，可使干細胞達到預期的表型。基于ECM制備的ECMH可更好的模擬干細胞微環境，從而達到提高干細胞治療效果的目的。Bordbar等[14]將羊膝關節軟骨ECMH與兔骨髓間充質干細胞共同培育，結果表明所制備的水凝膠具有良好的細胞友好性，可以保持干細胞存活。Wu等[15]將豬半月板通過改良的脫細胞作用和酶消化作用，制備成豬半月板組織來源的ECMH，再來培養牛軟骨細胞和小鼠3T3成纖維細胞，發現與聚苯乙烯培養比較，豬半月板ECMH能顯著提高牛軟骨細胞和小鼠3T3成纖維細胞的生存率和增殖速度。這些結果表明由于ECMH因其具有獨特的微觀結構、力學性能和生物活性，可為干細胞提供更加適宜的細胞微環境。

2.2 對干細胞無細胞毒性 要將ECMH應用于干細胞移植并發揮良好的治療效果，首先需要確保干細胞可在ECMH中良好生存。因此，ECMH是否具有細胞毒性決定著移植干細胞的命運。Getova等[16]將脂肪組織的ECM制備成水凝膠后，用于培養脂肪間充質干細胞，來評估該ECMH的細胞毒性，連續培養7 d后結果顯示水凝膠內細胞存活良好，并在ECMH中觀察到脂肪間充質干細胞的存活和遷移。梁成宵等[17]用Live/Dead染色試劑盒檢測大鼠肝細胞系BRL-3A細胞在肝臟ECMH中的存活情況,結果發現BRL-3A細胞在肝臟ECMH中培養1 d和3 d后BRL-3A細胞黏附數量明顯多于對照組，表明肝臟ECMH并無細胞毒性。以上結果均證明ECMH無細胞毒性，可以保證干細胞良好存活和遷移，有助于提高干細胞治療效果。

2.3 協同干細胞移植后有較低免疫原性 ECMH作為干細胞組織工程支架材料并應用于臨床疾病治療，除了需要考慮ECMH的細胞毒性，還需考慮其是否會引起移植后免疫排斥反應。Qiao等[18]將豬心肌組織來源的ECMH聯合脂肪間充質干細胞后，局部注射至急性心肌梗死后梗死邊界處的心肌中，連續觀察4 w后，發現脂肪間充質干細胞和心肌ECMH的組合可明顯增加血管生成，減少纖維化程度并減小梗塞面積，且未觀察到組織免疫反應。Zhang等[19]為了評估衍生自豬膀胱組織的膀胱ECMH在大鼠腦組織中的生物相容性及免疫原性，將膀胱ECMH直接注射到正常大腦后，發現多種大腦組織損傷評估指標無明顯變化，提示膀胱ECMH未引起大鼠腦組織免疫反應。因此，ECMH具有良好的生物相容性及低免疫原性的特點，這也有助于協助干細胞體內移植后發揮治療作用。

2.4 有助于干細胞存活 基于干細胞的療法可用于治療多種疾病和損傷，目前主要應用于臨床治療的多為間充質干細胞，其治療作用通常歸因于間充質干細胞釋放的細胞因子，這些細胞因子具有調節免疫、抑制炎癥反應或促進組織修復的作用[23]，因此保持干細胞的存活及增殖對干細胞治療效果有決定性作用。Jang等[21]分別使用豬心臟ECMH和膠原兩種不同的材料與人源心臟祖細胞聯合培養，發現心臟ECMH更能增強人源心臟祖細胞的存活、增殖和分化。Lin等[22]通過將豬外周神經脫細胞化后制備成ECMH用來培養施旺細胞(Schwann's cell)，發現豬外周神經ECMH中的細胞外基質成分和其納米纖維結構特征有助于促進施旺細胞存活和增殖。Ozpinar等[23]通過使用豬直皮ECMH與I型膠原水凝膠分別培養人源性肥大細胞來觀察豬直皮ECMH對肥大細胞代謝活性、細胞活力和受體表達的影響，結果在豬直皮ECMH中培養時，人源肥大細胞表現出不同的代謝活性，同時與肥大細胞成熟/激活相關的免疫球蛋白E（IgE）受體也被上調。上述實驗結果表明相較于傳統水凝膠，ECMH可明顯提高干細胞生存率并有助于干細胞增殖，是一種良好的干細胞培養基。

2.5 具有誘導干細胞向成體細胞分化的作用 干細胞移植治療的成功還取決于干細胞在移植后是否能夠保持其增殖、分化和表型的能力。Bordbar等[14]將羊膝關節軟骨ECMH與兔骨髓間充質干細胞共同構建干細胞復合體，觀察到嵌入在水凝膠內的骨髓間充質干細胞能夠分化成軟骨細胞。Zhang等[24]將制備的人胎盤ECMH與高傳代（P8）直皮乳頭細胞（dermal papilla cells，DPCs）混合成球體后，發現P8-DPCs在傳代表達缺失的與毛誘導能力相關的基因表達得到了恢復，進一步將水凝膠-干細胞復合體移植于裸鼠皮下，兩周后觀察到毛發再生，而單純細胞移植組無毛發再生現象，證明人胎盤ECMH可通過活化表達關鍵基因來調節DPCs的形態和功能，使原本不能表達的與毛誘導能力相關的基因表達得到了恢復。以上研究表明，ECMH具有促進干細胞增殖，并誘導干細胞向成體細胞分化的能力。

3 ECMH在干細胞移植治療中面對的問題

目前，ECMH由于其類似組織的物理特性、獨特的3D環境結構特性及出色的細胞外信號轉導特性，已被認為是干細胞培養的黃金標準[25]。隨著ECMH在干細胞培養和移植方面應用普及，其優勢逐漸得以體現，但將人體組織來源的ECMH應用于臨床治療，尚處于生物材料學領域的起步階段。此外，ECMH的臨床應用還需面對以下問題：（1）由于ECMH制備的原材料為動物組織和器官，在臨床應用中應盡可能降低組織來源差異引起的免疫反應，所以理想的材料為人體組織，這使得ECMH的原材料供應成為一個首要障礙；（2）從人體組織中獲取ECM必須面對個體間變異所產生的組織差異性，差異性的來源包括年齡、性別、種族等多個方面，這些差異極大的降低了ECMH的生產重復性，這種生產批次間的變異影響了其臨床應用；（3）由于ECM結構成分復雜，結構的多元化并不利于找們理解細胞外信號及ECM組分在細胞器形成中的作用，這些問題導致在干細胞治療中，很難根據干細胞種類及應用部位選擇最適合的ECMH。

4 ECMH應用于干細胞移植的展望

將ECMH應用于干細胞的體內移植，在臨床中的可行性仍未明確，但已有大量的文獻綜述表明ECMH在干細胞移植中的應用潛力。隨著合成和加工技術的發展，ECMH的設計將不斷更新。動態ECMH的發展不僅可以為干細胞提供良好的微環境，還將為干細胞提供更加多元的外部觸發因素（例如光、聲音）[26]。這些動態特性可以更加深層次的影響干細胞的生物信號傳導和力學結構形態，為干細胞治療提供更好的助力。