膿腫分枝桿菌復合群對克拉霉素耐藥基因的初步研究

王怡婷 鄭惠文 趙冰 夏輝 王勝芬 歐喜超 周楊 宋媛媛 鄭揚 趙雁林 申阿東

膿腫分枝桿菌(Mycobacteriumabscessus)是一種快速生長的對多種藥物具有先天性耐藥的非結核分枝桿菌，可引起80%的快生長分枝桿菌肺部感染[1]。克拉霉素是大環內酯類藥物的核心藥物，也是治療膿腫分枝桿菌感染的基石，但近期發現膿腫分枝桿菌對其耐藥率呈上升趨勢。盡管既往已有膿腫分枝桿菌對克拉霉素的耐藥機制研究[2-3]，但由于膿腫分枝桿菌存在不同的亞種、不同的基因型，其對克拉霉素的耐藥機制也不盡相同[4-6]。為進一步正確指導臨床選用克拉霉素，筆者對膿腫分枝桿菌復合群對克拉霉素的耐藥特征進行初步分析，為有效控制其耐藥提供新思路。

材料和方法

1.菌株來源：選取中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室保存的2016—2017年全國耐藥監測菌株中，鑒定為膿腫分枝桿菌復合群的385株臨床分離株作為研究對象。標準株ATCC 19977和CR 5701均來自中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室。質控菌株購自中國藥品生物制品檢定所。研究方案獲得首都醫科大學附屬北京兒童醫院醫學倫理審批(2020-k-158)。

2.菌種鑒定和耐藥基因分析：采用多靶位基因測序法。(1)菌種鑒定：將凍存于-80 ℃的菌株全部復蘇后接種于改良羅氏培養基，培養14 d后采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取菌株DNA。根據文獻合成16S rRNA[7]、rpoB[8]、轉錄間隔區[8]、hsp65[9]。先采用16S rRNA對菌株進行鑒定，若鑒定為膿腫分枝桿菌復合群則采用另3種靶基因進行鑒定，當3種結果均不一致時，排除該菌種診斷，當其中2種靶基因結果一致時則可確定為該菌種。(2)耐藥基因檢測：根據文獻合成erm(41)[5,10]、rrl[10]和rrs[11]基因特異性引物，引物序列見表1。20 μl PCR擴增反應體系為：2×Taq MasterMix 10 μl,上下游引物各0.4 μl(10 μmol),1.4 μl模板液，雙蒸水7.8 μl；PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min。引物的合成、擴增產物的純化，以及基因測序均由北京擎科生物技術有限公司完成。最后將測序得到的基因序列與GenBank數據庫中的序列進行比對。

表1 膿腫分枝桿菌復合群菌株耐藥基因擴增引物序列

3.藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)：采用美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微孔板稀釋法對克拉霉素、阿米卡星、阿奇霉素、頭孢西汀、亞胺培南、美羅培南、利奈唑胺、替加環素、莫西沙星、加替沙星、米諾環素、利福布汀、妥布霉素、左氧氟沙星等14種抗結核藥品進行藥敏試驗[12]；藥品的藥敏臨界值參照CLSI M24-A3指南[12]標準，對該指南中沒有藥敏臨界值的藥品，按以下原則參照：左氧氟沙星和加替沙星參考莫西沙星的藥敏臨界值，米諾環素和利福布汀參考堪薩斯分枝桿菌的藥敏臨界值，阿奇霉素參考文獻[13]，替加環素參考文獻[14]。

具體操作如下：刮取改良羅氏(L-J)培養基上處于生長對數期的膿腫分枝桿菌復合群菌株，將菌懸液配成0.5麥氏比濁濃度后，取50 μl加入到10 ml陽離子調節肉湯培養基中，以使最終接種液濃度約為7.5×105CFU/ml，顛倒混勻。分別將不同藥品加入到含有100 μl的陽離子調節肉湯培養基96孔板的第1列，倍比稀釋后加入100 μl稀釋后的菌液，最后1列為不含藥液的陽性對照，24 h后在無藥培養基孔中加入70 μl指示劑，孵育24 h后如培養基為紅色，則在所有含藥培養基中加入指示劑，觀察3 d 時菌株的生長情況，記錄該藥品對膿腫分枝桿菌復合群的最低抑菌濃度(MIC)。又因膿腫分枝桿菌復合群對克拉霉素的耐藥有2種類型，故對其分別觀察3、7、14 d的生長情況，并將3 d時即出現耐藥的菌株判定為獲得性耐藥，將3 d時為敏感、14 d時為耐藥的菌株判定為誘導耐藥菌株(菌株數=14 d時的耐藥菌株-3 d時的耐藥菌株)[5,10,12]。

4.統計學處理：采用SPSS 16.3軟件對研究菌株的耐藥情況進行描述性分析。

結 果

1.膿腫分枝桿菌復合群亞種和耐藥譜：385株膿腫分枝桿菌復合群菌株中，218株為膿腫分枝桿菌[包括185株為erm(41)T28基因型和33株erm(41)C28基因型]，163株為馬賽分枝桿菌，4株為博萊分枝桿菌(數據少，代表性低，不納入分析)。且阿米卡星、克拉霉素和阿奇霉素3種藥品對膿腫分枝桿菌和馬賽分枝桿菌的殺菌活性最強，見表2。

表2 14種抗結核藥品對膿腫分枝桿菌復合群的藥物敏感性試驗結果

2.膿腫分枝桿菌復合群對克拉霉素的耐藥特點： 31株為克拉霉素獲得性耐藥，其中，11株為erm(41)T28基因型，3株為erm(41)C28基因型，17株為馬賽分枝桿菌；173株為誘導耐藥株，其中，171株(98.8%)為erm(41)T28基因型，2株(1.2%)為馬賽分枝桿菌，見表3。

表3 膿腫分枝桿菌復合群在不同檢測時間點對克拉霉素的耐藥情況

3.膿腫分枝桿菌復合群對克拉霉素和阿米卡星的耐藥突變特點：在31株克拉霉素獲得性耐藥菌株中，10株膿腫分枝桿菌[包括7株erm(41)T28基因型和3株erm(41)C28基因型]及10株馬賽分枝桿菌均在rrl基因的2058/2059位點突變，最常見突變類型分別為A2058C和A2058G。13株對阿米卡星耐藥的菌株中，有9株[包括5株erm(41)T28基因型，2株erm(41)C28基因型，2株馬賽分枝桿菌]在rrs基因的A1408G位點發生突變，其中7株同時對克拉霉素耐藥[包括3株erm(41)T28基因型，2株erm(41)C28基因型，2株馬賽分枝桿菌]。具體見表4。

表4 31株克拉霉素獲得性耐藥的膿腫分枝桿菌復合群菌株rrl和rrs基因耐藥突變情況

討 論

膿腫分枝桿菌對克拉霉素的耐藥機制包括獲得性耐藥和誘導性耐藥，前者可與23S rRNA的rrl基因2058或2059位點突變有關，后者則與被克拉霉素誘導表達的編碼紅霉素核糖體甲基化酶的erm(41)基因有關。其中，有活性的erm(41)基因能催化23S rRNA的rrl基因2058或2059位點上的腺嘌呤甲基化而產生耐藥[3]。馬賽分枝桿菌是膿腫分枝桿菌的一個亞種，其erm(41)基因的274 bp缺失，可導致erm(41)基因失活。此外，基于erm(41)基因的第28位堿基存在多態性，其對克拉霉素可產生不同的耐藥，如erm(41)T28基因型能夠產生有活性的erm蛋白，可能與克拉霉素誘導性耐藥有關；而erm(41)C28基因型則對克拉霉素敏感[4-6]。本研究耐藥檢測顯示，erm(41)T28基因型的耐藥率由培養3 d時的5.9%上升至培養14 d時的98.4%，而erm(41)C28基因型的耐藥率則未發生變化，提示erm(41)T28基因型發生了誘導性耐藥。又因erm(41)基因只與大環內酯類藥物(如克拉霉素)和氨基糖苷類藥物(替代藥物，如阿米卡星)的耐藥具有相關性，本研究僅對這兩種藥品的耐藥性進行分析。

克拉霉素是治療膿腫分枝桿菌的核心藥品。治療失敗的主要原因是誘導性耐藥的產生。在膿腫分枝桿菌復合群中，與誘導性耐藥相關的erm(41)基因在不同菌種或基因型中存在明顯差異[4-6]，表明erm(41)基因的正確測序，以及分析膿腫分枝桿菌復合群對克拉霉素的耐藥特征，對于預測治療結果至關重要。

通過分析膿腫分枝桿菌復合群對不同藥品的藥敏試驗結果，筆者發現阿米卡星、克拉霉素和阿奇霉素對膿腫分枝桿菌的殺菌活性最強，并且阿米卡星的殺菌活性高于克拉霉素，這與之前研究結果一致[15]，然而，阿米卡星需要長期進行肌內注射或靜脈注射，限制了其在臨床中的應用，但隨著阿米卡星脂質體吸入懸浮液的出現，這種情形大大改善[16]，提示阿米卡星作為治療膿腫分枝桿菌復合群的理想替代藥品將成為現實。膿腫分枝桿菌對克拉霉素的獲得性耐藥率為8.1%，與法國的一項研究結果(9.09%)相近[17]，但低于我國(33.95%)[13]和韓國(15.84%)[18]的報道，高于巴西報道的5.55%[19]，這可能與不同研究中分離株的來源不同或患者治療病史差異有關。

通過分析不同亞型膿腫分枝桿菌對克拉霉素和阿米卡星的耐藥特點，筆者發現erm(41)T28基因型膿腫分枝桿菌對克拉霉素的誘導性耐藥率為98.8%，高于之前56.3%的報道結果[20]，推測這些分離株可能既往接觸過大環內酯類藥物如克拉霉素的治療，因此，在治療時不宜選擇克拉霉素。另外，已有研究表明馬賽分枝桿菌具有截短的非功能性的erm(41)基因[4]，即使延長耐藥檢測孵育時間也無法誘導克拉霉素耐藥，而本研究中有2株馬賽分枝桿菌對克拉霉素表現為誘導性耐藥，其發生機制目前還不清楚，有待進一步研究。Bastian等[10]研究表明，rrl基因突變發生在erm(41)T28基因型菌株中，而本研究中erm(41)T28和erm(41)C28基因型膿腫分枝桿菌中均發生了rrl基因突變，表明rrl基因的選擇突變在erm(41)T28和erm(41)C28基因型菌株中相似，推測這可能與患者治療史有關。而7株對克拉霉素耐藥的馬賽分枝桿菌在rrl基因的2058/2059位點無突變，其耐藥機制需要進一步研究。

綜上所述，erm(41)T28基因型膿腫分枝桿菌更易誘導克拉霉素耐藥。膿腫分枝桿菌和馬賽分枝桿菌最常見的獲得性耐藥突變位點分別是A2058C和A2058G。