腦脊液標志物在結核性腦膜炎診斷中的研究進展

諶蒙蒙 董靜 賈紅彥 張宗德 潘麗萍

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)通過血行播散侵入軟腦膜形成結核結節，結核結節破潰后病灶內大量MTB進入蛛網膜下腔引起的非化膿性炎性疾病。TBM作為致死率和致殘率最高的結核病類型，其死亡率在10%～36.5%[1-2]。目前確診TBM的金標準是腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)抗酸染色涂片或MTB培養陽性，但是CSF抗酸染色陽性率低，只有10%～20%，MTB培養時間長(1～8周)且不夠敏感(敏感度為36%～81.8%)[2]，因此對TBM的早期診斷不具有明顯的臨床意義。近年來，WHO推薦GeneXpert MTB/RIF技術用于疑似TBM患者的診斷，雖然GeneXpert MTB/RIF技術對CSF標本中MTB的診斷具有較高的特異度(98.1%)，但是敏感度相對較低(63%)。因此，GeneXpert MTB/RIF技術僅可以作為TBM診斷的納入標準而不能用于排除標準，需要結合其他高敏感度的檢測方法用于TBM的早期診斷[3]。

由于TBM患者早期的臨床表現和影像學變化均不具有特異性，且缺乏有效的實驗室診斷方法，致使TBM的早期診斷異常困難。然而，早期診斷TBM對于患者的及時治療和改善預后至關重要。目前的研究顯示，CSF中存在多種生物標志物，可用于TBM的早期診斷，包括MTB來源的生物標志物和宿主來源的生物標志物。其中較為常見的MTB生物標志物包括脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)[4]、早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、培養濾液蛋白10(CFP-10)[5]、抗原Ag85B[6]、熱休克蛋白X(hspX)和蘋果酸合成酶G(GlcB)[7]等，它們作為MTB特異性抗原指標，可直接反映MTB進入機體的情況。近年來關于宿主生物標志物的研究，大致可分為蛋白、RNA和代謝物，它們反映了MTB感染后機體免疫應答的指標變化，與疾病的進展轉歸密切相關。本文主要針對目前CSF中宿主診斷生物標志物用于TBM診斷的進展和挑戰展開綜述。

一、CSF中細胞因子標志物對TBM的診斷

MTB感染機體后，引起以T淋巴細胞介導的細胞免疫反應和遲發型變態反應為主的免疫反應，而細胞因子在免疫反應的調節中起重要作用，如誘導細胞黏附分子的形成、促進中性粒細胞的遷移以及炎癥介質的釋放等，從而加強炎癥反應。因此，通過檢測某些細胞因子可能有助于TBM 的早期診斷、病情評估及預后判斷。

目前γ干擾素釋放試驗(interferon-γ release assays, IGRA)已經廣泛應用于臨床。Yu等[8]研究發現，CSF 中的IGRA檢測對于診斷TBM效果優于外周血中的IGRA檢測，在外周血和CSF中檢測的敏感度分別為78.0%和77.0%，特異度分別為61.0%和88.0%，受試者工作特征曲線下面積(AUC)分別為0.76和0.83。可見，通過檢測CSF中的γ-干擾素(IFN-γ)水平可以幫助診斷TBM患者。

除IFN-γ外，也有多種細胞因子被證明與TBM疾病相關。Sharma等[9]發現，TBM患者血清和CSF中各種促炎細胞因子的水平顯著升高，包括白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-2 (IL-2)、白細胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IFN-γ，且血清和CSF中的促炎細胞因子水平與TBM的嚴重程度相關。Kwon等[10]發現，TBM組CSF中腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)、白細胞介素12亞單位β(IL-12p40)、白細胞介素13(IL-13)、巨噬細胞炎蛋白α(MIP-1α)、可溶性程序性死亡因子1(PD-1)和程序性死亡受體配體1(PD-L1)的水平明顯高于非TBM組，且IL-12p40、IL-13、MIP-1α、可溶性PD-1和PD-L1的濃度對TBM診斷的敏感度都在80%以上，因此，CSF中IL-12p40、IL-13、MIP-1α、可溶性PD-1和PD-L1水平可能是早期診斷TBM的有效輔助指標。在兒童TBM患者中，Manyelo等[11]發現，血管內皮生長因子(VEGF)、IL-13和抗菌肽LL-37 可以作為兒童TBM患者輔助診斷的工具，且用IFN-γ和髓過氧化物酶(MPO)分別替代IL-13和抗菌肽LL-37后可以提高TBM診斷的準確性(敏感度為82.6%，特異度為95.8%)。

以上研究顯示，TBM患者CSF中存在多種細胞因子指標改變，且細胞因子水平與TBM患者疾病嚴重程度(包括CSF間隙滲出物，導致粘連、腦積液和閉塞性血管炎等腦損傷并發癥)密切相關。因此，可以通過監測細胞因子水平來反映TBM患者的疾病進程及預后。隨著IGRA檢測技術的發展，IFN-γ目前已經應用于臨床輔助診斷TBM患者，但是存在敏感度不高的問題。TNF-α作為重要的促炎細胞因子，對TBM患者疾病發展起著重要作用。但是，單個細胞因子標志物很難直接作為TBM患者的診斷工具，因為大部分炎性細胞因子在其他炎性疾病中也會存在改變，因此需要通過多種細胞因子聯合來提高TBM診斷的準確性。

二、CSF中其他蛋白標志物對TBM的診斷

目前ADA已經作為臨床上診斷TBM的常規檢查，但是缺乏統一的ADA閾值標準，限制了該指標用于TBM診斷的實際應用價值。Shekhawat等[12]研究證明，在MTB感染后，宿主的熱休克蛋白(hsps)水平發生改變(hsp25、hsp70和hsp90水平均有所升高、hsp60水平有所下降)。且Shekhawat 等[13]的另一項研究顯示，hsp70和hsp90在TBM診斷中的敏感度分別為89%和88%，特異度分別為82%和89%，組合hsps (hsp25、hsp60、hsp70和hsp90)能更有效診斷TBM患者。Yang等[14]發現尼爾樣2型分子(NELL2)是TBM組中神經元特異性差異最大的蛋白，TBM組NELL2水平較健康對照組明顯降低，且NELL2能夠以83.3%的敏感度和75%的特異度來區分TBM患者與健康對照者。Chen等[15]發現，CSF中高遷移率族蛋白1(HMGB-1)水平對于TBM診斷的敏感度雖然不高(61.02%)，但具有較好的特異度(89.94%)，鑒別TBM高危患者與非神經系統的其他結核病患者(如肺結核、腸結核或關節結核)的敏感度為79.49%，特異度為94.52%，提示CSF中HMGB-1水平是TBM高危患者早期鑒別診斷較好的指標。Peng等[16]發現，TBM患者CSF和血清中Delta-like 1配體(DLL1)水平均明顯增高，且CSF中DLL1含量與血清中DLL1含量呈正相關，表明CSF和血清中DLL1的水平對TBM的診斷具有潛在的價值。譚燕[17]發現，TBM患者組CSF和血清中的單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)水平均明顯高于對照組，且經過治療后有所改善，提示MCP-1對TBM診斷具有一定的價值。可見，宿主的hsp25、hsp60、hsp70和hsp90組合用于TBM診斷顯示出了較高的價值，可能是由于宿主hsp具有分子伴侶功能，而且是對抗病原體免疫反應中的主要免疫原，因此在TBM發展中起著重要作用[13]。其他單一蛋白(NELL2、HMGB-1和DLL1等)也在TBM診斷中的不同方面顯示出一定的潛在價值。但這些指標單獨用于TBM的診斷效能相對有限，可能需要進一步探索不同蛋白組合來提高診斷價值。

三、 CSF中RNA標志物對TBM的診斷

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)在組織、血液或CSF中的異常表達與人體多種疾病的發生發展有著密切關系，包括結核病[18]。Pan等[19]發現CSF和外周血miR-29a在兒童TBM患者中的表達水平明顯高于對照組，診斷TBM的AUC均大于0.85，且miR-29a表達與顱內壓增高、意識障礙、局灶性腦癥狀、腦膜刺激、水腫、腦電圖異常和腦外結核等因素密切相關，說明檢測miR-29a的表達水平可以幫助早期診斷兒童TBM患者，且聯合CSF與外周血中的miR-29a 進行分析可顯著提高TBM的診斷價值。另一項研究描繪了TBM和病毒性腦炎(VM)患者的miRNA表達譜，以更好地了解這兩種疾病的發病機制，發現TBM患者外周血4個miRNA 組合(miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p、miR-199a-5p) 具有較好的識別能力(AUC=0.89，敏感度為90.6%，特異度為86.7%)，且其中3個miRNA (miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p)的表達量在TBM和病毒性腦膜炎患者的CSF樣本中差異有統計學意義[20]。

外泌體是由活細胞分泌釋放到體液中直徑為30～100 nm的微泡，內含有RNA和蛋白質分子，參與細胞間通訊和免疫調節。在不同的外泌體生物標志物中，miRNA被認為是最有前途的候選生物標志物，因為它具有高豐度、固有的穩定性和易于采樣等特點[21]。尹慧敏等[22]發現，CSF外泌體let-7d在不同類型的腦膜炎患者中存在差異性表達，在化膿性腦膜炎及TBM患者中let-7d表達明顯低于病毒性腦膜炎和正常組，同時化膿性腦膜炎患者let-7d的表達水平明顯低于TBM患者，提示通過檢測CSF外泌體let-7d的表達水平可以用來區分不同類型的腦膜炎患者。路雁惠等[23]發現let-7d在TBM患者CSF外泌體中的表達水平明顯下降，可作為TBM診斷及與相關腦炎鑒別診斷的潛在生物學標志物。Hu等[24]發現6個miRNA (miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-106a、miR-191、miR-486)在結核病患者血漿外泌體標本中存在表達差異，通過機器模擬算法與miRNA結合診斷，在TBM中AUC達到0.97，表明檢測外泌體miRNA含量可以提高TBM的臨床診斷水平。

信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)差異性表達可以反映TBM進展。Rohlwink等[25]發現，兒童TBM患者全血和CSF的兩個不同部位(腦室和脊髓)的轉錄表達譜發生改變，TBM患者與健康對照者全血樣本中存在2230個差異基因表達。可見，TBM有明顯的免疫應答模式，典型和非典型炎性小體活化顯著增加，T細胞活化明顯降低。TBM患者與非結核腦部感染對照者腦室CSF樣本中存在312個差異基因表達，顯示腦室CSF轉錄表達譜改變與神經元興奮性毒性和腦損傷相關；TBM患者兩個不同部位CSF之間存在389個差異基因表達，顯示脊髓CSF轉錄表達譜改變與蛋白質翻譯和細胞因子信號相關；反映了TBM患者外周、中樞神經系統以及腦區內的疾病發展過程是不同的。另有其他研究發現，B淋巴細胞、巨噬細胞和胸膜微環境中mRNA的差異性表達也與結核病的發生發展相關聯[26-28]。

雖然至今尚未發現與TBM相關的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和環狀RNA (circular RNA, circRNA)標志物，但He等[29]發現，結核病患者與社區獲得性肺炎患者和健康對照者的血漿中存在12個差異性表達的lncRNA，且進一步驗證顯示2種lncRNA——ENST00000354432和ENST00000427151在結核病患者血漿樣本中的表達顯著上調，當截斷值分別設定為0.05和0.03時，有82%的結核病患者的表達水平高于這兩個截斷值，且沒有社區獲得性肺炎患者和健康對照者，提示血漿中lncRNA的表達水平與結核病具有一定的相關性，這兩個lncRNA 可能是結核病快速診斷的潛在生物學標志物。

目前，關于TBM患者CSF中RNA標志物的研究主要集中在miRNA方面，且這些研究提示miRNA可能是診斷TBM的潛在生物標志物。但是，大部分研究是針對血漿、細胞等樣本材料進行miRNA的篩選和驗證，針對CSF的研究仍然較少。對于TBM來說，CSF是其病灶部位的直接相關體液，其中蘊含豐富的疾病信息，可以直接反映疾病的發生發展。因此，尚需要進一步開發針對TBM患者CSF特異性miRNA的深入研究。目前關于TBM患者CSF中mRNA、lncRNA和circRNA標志物的研究較少，但其在結核病診斷和治療中的潛在價值已顯現，未來仍需要進一步探索它們在TBM患者中的診斷價值。

四、CSF中代謝標志物對TBM的診斷

眾所周知，MTB感染會改變機體的代謝過程。臨床上發現TBM患者普遍存在CSF葡萄糖、氯化物水平降低和乳酸水平升高等改變，通過對CSF葡萄糖、氯化物和乳酸濃度變化的監測，對判斷TBM患者的狀態和TBM病情轉歸具有一定的指導意義。目前代謝組學研究也發現其他多種新的代謝物與TBM疾病相關聯。Li等[30]通過CSF代謝組學發現25種有助于區分TBM和病毒性腦膜炎患者的關鍵代謝物，包括參與氨基酸、碳水化合物、脂蛋白和脂質、核苷代謝的分子和其他有機分子，這些代謝標志物可能是TBM鑒別診斷的潛在生物標志物。Zhang等[31]發現，能區別TBM與病毒性腦膜炎、細菌性腦膜炎和陰性對照組的代謝物分別有23種、6種和21種，它們與TBM患者CSF代謝物的差異主要涉及碳水化合物、氨基酸和脂質等代謝。Dai等[32]發現，與其他類型的腦膜炎相比，TBM患者CSF中存在大量代謝物水平的增加，其中主要的代謝物結果有所不同，包括氨基酸、尿素、脂類、脂肪酸、膽紅素、膽汁酸和尿酸，主要涉及氨基酸、脂類和核苷的代謝，因此可以通過TBM和其他類型腦膜炎的不同代謝特征，確定潛在的代謝生物標志物用于TBM患者的鑒別診斷。在兒童TBM患者中，Van等[33]研究發現，有8種代謝物(2-羥基丁酸鹽、肉堿、肌酸、磷酸肌酸、谷氨酸鹽、谷氨酰胺、胍基乙酸鹽和脯氨酸)與兒童TBM密切相關，它們與糖代謝失控、脯氨酸和肌酸代謝上調和谷氨酸-谷氨酰胺循環受阻相關，因此通過分析兒童TBM患者的代謝特征，可幫助兒童TBM患者進行早期診斷。

以上研究顯示，CSF中多種代謝物與TBM疾病相關聯，主要參與了碳水化合物、氨基酸、脂類和核苷酸等代謝過程，通過分析CSF中代謝物特征有助于TBM的早期診斷。但是代謝水平相對較復雜，實現臨床應用可能會比較困難。

五、 總結與展望

綜上所述，CSF中存在多種宿主生物標志物與TBM疾病進展及轉歸密切相關的蛋白、RNA和代謝標志物。目前發現部分宿主生物標志物顯示出對TBM診斷具有較高敏感度和特異度，主要集中于細胞因子和其他CSF蛋白標志物，RNA層面研究相對較少，代謝物類別復雜，因此，這些標志物距離應用于臨床仍需要大量研究去驗證。目前的研究提示宿主標志物與數學模型結合更有利于提高TBM早期診斷效能，因此，未來可能通過CSF中宿主標志物的多組學聯合來尋求更好的TBM早期診斷方法。此外，相對于細胞或組織而言，CSF中相關標志物的表達水平會相對較低，可能會給CSF中宿主標志物的研究和進一步的廣泛應用帶來一定的困難，未來需要開發敏感度更高的檢測技術以更好應用這些標志物。