CRISPR-Cas系統在結核分枝桿菌研究中的應用進展

楊瑞芳 李傳友

近年來，隨著結核病患者例數的增加，以及耐多藥結核分枝桿菌(multiple drug-resistanceMycobacteriumtuberculosis，MDR-MTB)和廣泛耐藥結核分枝桿菌(extensively drug resistantMycobacteriumtuberculosis，XDR-MTB)菌株的廣泛流行，結核病的防治形勢愈發嚴峻[1]。盡管宿主細胞中存在多種不同的免疫應答機制以抵抗MTB，但是MTB也進化出了相應的生存機制，從而對抗宿主細胞的殺傷作用。然而，截至目前MTB的致病機制以及與宿主的相互作用等諸多問題卻并沒有完全明確，而且目前基于MTB疫苗和新型藥物的抗結核治療的研發進展極為緩慢。因此，臨床上對結核病的診斷和治療仍然面臨著巨大的挑戰。目前亟需建立一套完善且快速高效的MTB遺傳操作系統，對于深入研究MTB基因的功能，了解MTB的致病及耐藥機制，尋找耐藥基因，進而開發新型抗結核藥物和疫苗具有重要意義。

成簇的規律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)最初源于Ishino等在分析大腸埃希菌中的堿性磷酸酶的同工酶(isozyme-converting alkaline phospatase，Iap)基因進行核酸序列分析時被發現[2]，但當時并未引起國內外研究者的重視。直到2002年，研究者通過生物信息學方法在細菌和古細菌基因組中找出相似且廣泛存在的短重復序列及其間隔序列相關的基因，并將此種序列命名為“成簇的規律間隔短回文重復序列(CRISPR)”，與其相關的蛋白編碼基因命名為CRISPR相關基因(CRISPR associated genes，Cas)[3]，在此基礎上，CRISPR的相關研究才逐漸展開。目前，CRISPR-Cas系統主要以細菌抵御外源DNA入侵時產生的自我保護機制為研究熱點。根據CRISPR-Cas系統中Cas基因種類的多樣性以及Cas蛋白作用機理的不同可以分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[4]。其中，Ⅲ型CRISPR系統主要存在于古細菌中，系統較為復雜，主要有A、B兩種類型，而MTB的CRISPR-Cas系統屬于Ⅲ-A型[5]，參與抗結核的免疫應答反應。近年來，隨著對CRISPR-Cas系統的深入研究，發現該系統可能與調控MTB毒力表達、耐藥及定向基因編輯方面存在一定的關系[6-7]。筆者就近年來CRISPR-Cas系統在MTB免疫和生理調控研究中的應用進展進行綜述。

CRISPR-Cas系統對MTB的免疫調控機制

CRISPR-Cas系統是由前導區(leader)、重復序列(repeat)、間區(spacer)及CRISPR周圍相關蛋白組成，Cas基因編碼構成多種具有不同生理功能的Cas蛋白。不同的物種具有不同的前導區和重復序列，是因為前導區可作為CRISPR轉錄時的啟動區和轉錄因子的結合位點，而CRISPR位點有多個重復序列，但它們都有一個共同特征，即均有一個回文結構，重復序列之間存在間區[8]。MTB中的CRISPR系統都有2個CRISPR位點[9]，一個具有24個重復序列，而另一個具有18個重復序列。由于這兩個CRISPR的重復序列不同。因此，它們屬于兩個不同的CRISPR位點。

CRISPR-Cas系統介導的免疫保護機制發揮主導作用，可以裂解MTB，保證宿主細胞的正常功能。此外，CRISPR-Cas系統還可以激活特異性免疫記憶應答，預防同類外源DNA的再次入侵[10-13]。主要包括3個階段：(1)適應階段：主要獲取間隔序列并將其整合到CRISPR基因座。CRISPR系統會在前導序列與第一段重復序列之間插入一段與外源性基因片段同源的短DNA片段，同時伴有重復序列的復制。(2)表達階段：新的間隔序列整合到CRISPR基因座后，經轉錄產生長前體crRNA與crRNA加工成熟的階段，具體表現為這一前體crRNA在重復序列處被剪切，并被Cas內切酶加工成短小的crRNA，然后與Cas蛋白結合形成Cas-crRNA作用復合體。(3)干擾階段：在crRNA的指導下靶向定位與裂解外源性核酸[11-13]。

CRISPR-Cas系統對MTB生理功能的調控

一、CRISPR-Cas系統用于轉錄調控和基因編輯

近年來，國內外研究者發現CRISPR-Cas系統可用于干擾目的基因的轉錄，而研究最多的是Cas9，且當Cas9的內切酶結構域發生突變時，會因失去核酸內切酶活性而產生無活性的Cas(dCas9)。dCas9一方面可以通過結合到基因的啟動子序列或者與轉錄抑制因子結合，從而抑制轉錄過程。另一方面，dCas9也可以與轉錄激活因子結合而激活基因的轉錄[14-16]。此外，劉雅婷[17]發現Cas6和Cas10也參與了crRNA的加工過程。Cas2是一種保守的RNA內切酶，存在于含有CRISPR的MTB基因組中，可以編碼基因Rv2816c的轉錄，且隨代謝抑制劑的治療而變化，如抗生素和應激劑等[9,18]。此外，Zhang等[18]研究通過將Cas6開放閱讀框(ORF)上游的197 bp的DNA片段克隆到無啟動子的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)報告子質粒中，并將該Cas6-lacZ報告子質粒轉化到BCG wildtype(WT)和Rv2837c(cnpB)缺失株(△cnpB)中，發現cnpB可以控制結核分枝桿菌復合群(MTBC)的CRISPR-Cas系統的轉錄，且通過一種高度保守的3′-5′寡核苷酸酶控制crRNA水平。

目前，基因編輯被認為是生物研究中較常用的可以促進基因鑒定和表征的一種有效技術。近幾年來，CRISPR-Cas9系統作為新一代的基因編輯技術，研究愈發熱門，它屬于Ⅱ型 CRISPR系統。CRISPR-Cas9系統通過兩種RNA和一種Cas蛋白精確地對雙鏈DNA進行切割，從而實現基因編輯[16,19]。因此，未來在基因編輯和轉錄調控上，CRISPR-Cas9系統將發揮更大的作用。同時，CRISPR-Cas9系統靶向的準確性以及產生DNA雙鏈斷裂的效率也促進了基因編輯和基因治療的發展[20-21]。此外，來自細菌的CRISPR-Cpf1系統也已被開發為高效的基因編輯工具[22]。

Yan等[23]通過改進非同源末端連接修復通路，并開發了一種基于CRISPR切割和非同源末端連接修復途徑的基因組編輯工具。與傳統的方法相比，它可以有效地在MTB中同時產生雙突變和大規模的基因突變。因此，他們預計這種CRISPR-NHEJ輔助的基因組編輯系統將在MTB研究、疫苗開發和藥物靶點分析等方面具有深遠的應用價值。Rock[24]發現從嗜熱鏈球菌中提取的Cas9酶在恥垢分枝桿菌中具有優異的性能特征，因此開發了一種優化的CRISPR干擾(CRISPRi)系統，用于MTB的靶向基因沉默。在這個系統中，dCas9-sgRNA復合物與靶基因結合，通過阻斷RNA聚合酶啟動子通路或轉錄延長而影響轉錄過程。他們提出，基于CRISPR新的功能，基因組的應用可能會產生一個更強大的結核病抗生素發現平臺，從而有助于實現MTB基因組測序，以及開發全新的抗結核藥物[24-25]。此外，部分研究發現CRISPRi方法不僅可以在MTB中實現多基因靶向調控，也可以對其他高危險性的非結核分枝桿菌(NTM)實現基因調控，這些結果為MTB基因組特征的全面認識，明確致病機制提供新的方案與思路[26]。另一方面，國外研究指出，噬菌體療法結合CRISPRi可能成為一種新的有效解決方案來應對MDR-MTB、XDR-MTB菌株的不斷出現[22]。Singh等[27]通過對141個分枝桿菌基因組進行了比較分析，表明MTBC北京譜系CRISPR-Cas系統可能是由于插入序列IS6110的轉位所致，提示CRISPR-Cas系統可能在決定MTB不同譜系中也發揮著至關重要的作用。另一方面，Zhang等[28]在體外利用引物延伸方法，發現CRISPR-Cas系統Csm1(一種Ⅲ-A型 CRISPR-Cas系統效應復合物中的重要蛋白，具有核酸酶活性)可以有效地延伸DNA引物鏈，提出MTB Csm1具有DNA聚合酶活性。

二、CRISPR-Cas系統對MTB毒力的調控

Cas2(Rv2816c)——一個已經被報道的，可以在間區獲得過程中發揮重要作用的保守RNA核酸內切酶，參與了逃避巨噬細胞免疫過程。國外一項研究表明，嗜肺軍團菌的Cas2是侵染宿主不可或缺的重要因素，后猜測Cas2可能與MTB毒力及一些生理過程存在一定的關系[29]。而國內黃琴琴[10]通過研究證明，Cas2的過表達使恥垢分枝桿菌單菌落形態發生改變，生長速率加快，影響生物膜的形成和滑動能力，以及降低恥垢分枝桿菌在巨噬細胞中的存活率等，因此他們也推測Cas2可能與其毒力相關。

Csm5(Rv2819c)和Csm4(Rv2820c)表達的兩種Cas蛋白屬于同一類蛋白家族。國外學者對Rv2820c分別進行體內和體外研究，發現兩種實驗中均可以促進MTB的毒力[30]。此外，Rindi等[31]通過比較基因組學后，發現Csm5在MTB減毒株H37Ra中的表達量與在MTB標準株H37Rv中相比較，出現明顯下調，提示Csm5可能與MTB的毒力存在一定關系。這種同源基因表現出不同表型差異的現象以及發生毒力改變是未來結核病研究的熱點。

吳曉麗[32]通過制備抗Csm3多克隆抗體，發現Csm3作為MTB CRISPR-Cas系統中的一種分泌蛋白，能夠幫助細菌抵抗巨噬細胞的吞噬，從而提高細菌毒力。此外，他們的研究結果發現Csm3并不能引起巨噬細胞的凋亡，但是可以引起較弱的T細胞反應，可見，CRISPR-Cas系統不僅與MTB的毒力有關，還可能與宿主免疫相關。

三、CRISPR-Cas系統對MTB耐藥性的調控

MDR-MTB和XDR-MTB菌株的出現和傳播增加了結核病治療的難度。同時，也使開發新的有效的抗結核藥物更加具有挑戰性[1]。因此，利用噬菌體特異性感染分枝桿菌進行結核病治療已成為MDR-TB和XDR-TB的一種新的治療方法。但在治療過程中，MTB對噬菌體的耐藥性迅速上升嚴重影響治療效果[33-34]。Cas1是Cas家族中最保守的蛋白質，是一種金屬依賴的DNA特異性內切酶，可以將間隔基整合到CRISPR序列中[33]。不同細菌屬的Cas1顯示出相關但不同的生化特性，更為有意義的是發現Cas1的缺失可能和耐藥性相關[35]，然而，Brudey等[36]發現北京譜系MTBC 即使在敲除Cas1基因后仍然是結核病高發地區非常成功的病原體。Wei等[7]重點研究了Ⅲ-A型CRISPR系統和Cas1的功能，發現抗生素或環境刺激可以使Cas1缺失株更容易轉變為持留狀態，使MTBC最終發展為耐藥菌的可能性增加，而這個結果提示Cas1可能參與MTB的耐藥性和應激反應。Cas1作為CRISPR-Cas系統的重要相關蛋白，盡管在其他細菌或腫瘤中的作用已經得到了深入的研究，但對于MTBC的研究還不完全清楚。因此，關于Cas1功能的進一步研究仍然具有重要的意義。

綜上所述，CRISPR-Cas系統已廣泛應用于MTB的表達調控、耐藥基因和遺傳修飾等多方面，提示其在未來MTB生物學研究領域中具有強大的影響力。此外，隨著CRISPR-Cas系統的臨床應用逐漸成熟，將為結核病的臨床診斷、新型抗結核藥物和疫苗的研究提供一種新的思路。但依然需要對CRISPR-Cas系統進行深入研究，不斷探討和發現該系統的潛在功能，深入了解MTB的致病和耐藥機制，為結核病的治療策略提供更多理論依據和技術支持。