吡嗪酰胺酶活性與耐多藥肺結(jié)核近期臨床療效的相關(guān)性研究

吳碧彤 蔡杏珊 鄺浩斌 劉志輝 孟繁榮 王楠 高俊文 譚守勇

吡嗪酰胺(pyrazinamide)是唯一具有殺滅酸性環(huán)境中或巨噬細(xì)胞內(nèi)半休眠狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌效果的抗結(jié)核藥品，其可顯著縮短初治肺結(jié)核的治療療程，提升治愈率。隨著吡嗪酰胺在結(jié)核病治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，其耐藥率明顯上升[1]。吡嗪酰胺耐藥率上升給耐多藥肺結(jié)核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis，MDR-PTB)的治療帶來(lái)不利影響，但現(xiàn)階段吡嗪酰胺的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)存在諸多缺陷，如陽(yáng)性率低、檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)重復(fù)性差等[2]。由于吡嗪酰胺僅在pH值為5.5的酸性條件下才能轉(zhuǎn)化為具有殺菌活性的吡嗪酸，而結(jié)核分枝桿菌在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)不良，使傳統(tǒng)藥物敏感性檢測(cè)方法不能可靠地反映菌株對(duì)吡嗪酰胺的耐藥情況，進(jìn)而導(dǎo)致吡嗪酰胺耐藥性檢測(cè)成為實(shí)驗(yàn)室檢查的一個(gè)難題。吡嗪酰胺的殺菌作用是在吡嗪酰胺酶的作用下轉(zhuǎn)化為有活性的吡嗪酸，吡嗪酸能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生殺滅作用。有研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺耐藥菌株的出現(xiàn)可能與吡嗪酰胺酶的活性喪失有關(guān)，吡嗪酰胺酶失活將導(dǎo)致吡嗪酰胺無(wú)法轉(zhuǎn)變?yōu)檫拎核幔M(jìn)而無(wú)法實(shí)現(xiàn)殺滅結(jié)核分枝桿菌的效果[3-4]。為明確吡嗪酰胺酶活性檢測(cè)是否有利于指導(dǎo)MDR-PTB患者使用吡嗪酰胺進(jìn)行治療，本研究采用前瞻性的研究方法，分析了吡嗪酰胺酶活性、吡嗪酰胺表型耐藥與MDR-PTB近期臨床療效的相關(guān)性。

資料和方法

一、研究對(duì)象

本研究經(jīng)廣州市胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)：胸醫(yī)倫理〔2017〕26號(hào))，患者知情并同意研究的內(nèi)容。研究將廣州市胸科醫(yī)院2018年7月1日至2019年12月31日收治的85例MDR-PTB患者作為研究對(duì)象。其中，男性54例，女性31例；年齡23～57歲，平均年齡(38.6±7.4)歲；73例并發(fā)空洞。剔除9例丟失、中斷治療、失訪患者，最終76例納入研究。76例患者中，病灶位于左側(cè)9例，右側(cè)17例，雙側(cè)50例；67例患者并發(fā)空洞。

二、納入、排除及退出標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《WHO耐藥結(jié)核病治療指南(2016更新版)》[5]中關(guān)于耐多藥結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡18～65歲；(3)治療前痰培養(yǎng)為陽(yáng)性，并獲得一二線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果；(4)患者同意抗結(jié)核治療并簽署參與項(xiàng)目同意書(shū)。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在二線注射類抗結(jié)核藥品(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐藥和(或)氟喹諾酮類藥品(氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星)耐藥；(2)合并嚴(yán)重肝病[如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)或天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)≥2.5倍正常值]；(3)合并腎病史(如血肌酐>177 μmol/L)；(4)合并精神疾病史；(5)孕婦及糖尿病患者；(6)合并塵肺病史；(7)HIV抗體陽(yáng)性；(8)長(zhǎng)期使用免疫抑制劑；(9)嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良。

3. 退出標(biāo)準(zhǔn)：(1)因藥物不良反應(yīng)而更改治療方案；(2)中斷治療≥2個(gè)月；(3)失訪。

三、研究方法

2. 治療方法：所有患者均給予WHO推薦的耐多藥結(jié)核病治療方案(6Am-Mfx-PZA-Pto-Cs/18Mfx-PZA-Pto-Cs)進(jìn)行治療。具體用藥方法：阿米卡星0.4 g/次，1次/d，肌內(nèi)注射或靜脈注射；莫西沙星0.4 g/次，1次/d，口服；吡嗪酰胺1.5 g/次，1次/d，口服；丙硫異煙胺0.2 g/次，3次/d，口服；環(huán)絲氨酸0.25 g/次，2次/d，口服。治療期間對(duì)患者進(jìn)行隨訪跟蹤，每個(gè)月進(jìn)行復(fù)查，包括3次痰涂片找抗酸桿菌、1次痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，記錄患者每個(gè)月的痰菌情況及藥物不良反應(yīng)發(fā)生情況；每2個(gè)月行1次胸部X線攝片檢查，記錄病灶變化情況。

3. 吡嗪酰胺酶活性檢測(cè)：采用Wayne法檢測(cè)，將2.35 g 7H9肉湯培養(yǎng)基，450 ml超純水，2 ml甘油，400 μg/ml 吡嗪酰胺，1.5%瓊脂糖混勻高壓滅菌，分裝5 ml于滅菌管中，保持管直立，備用。從羅氏培養(yǎng)基上刮取盡可能多的生長(zhǎng)良好的細(xì)菌，分別接種于2個(gè)培養(yǎng)管中，于37 ℃培養(yǎng)，其中一管培養(yǎng)7 d，另一管培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)7 d后取出一管加入1 ml 1%的硫酸亞鐵氨(現(xiàn)用現(xiàn)配)，于4 ℃冰箱內(nèi)放置4 h后取出，在日光燈下，以白紙作為背景，通過(guò)肉眼觀察培養(yǎng)管中的顏色變化，結(jié)果至少經(jīng)過(guò)2名研究者確認(rèn)。結(jié)果判讀：透明培養(yǎng)管中出現(xiàn)紅色條帶者(各種程度)，即為吡嗪酰胺酶陽(yáng)性；如無(wú)紅色條帶，14 d后取出第二管，依上法進(jìn)行測(cè)定，如仍無(wú)紅色條帶即為吡嗪酰胺酶陰性。

4. 吡嗪酰胺藥物敏感性檢測(cè)：采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)法，取結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物，制備1 mg/ml 菌懸液，稀釋到106CFU/L，取0.5 ml菌懸液加入至吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)專用MGIT培養(yǎng)管中(含吡嗪酰胺添加劑，藥物濃度100 μg/ml)；以菌懸液1∶10的比例稀釋加入至吡嗪酰胺藥敏專用MGIT培養(yǎng)管中(生長(zhǎng)對(duì)照管；不含吡嗪酰胺)。然后置于BACTEC MGIT 960儀器中，儀器根據(jù)分枝桿菌生長(zhǎng)情況自動(dòng)報(bào)告藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

5. 療效評(píng)估：比較MDR-PTB患者治療2、4、6個(gè)月末痰菌陰轉(zhuǎn)、病灶吸收和空洞閉合情況。

1)痰菌陰轉(zhuǎn)：采集患者痰液，痰液涂片檢查抗酸桿菌3次，結(jié)果均呈陰性，視為痰菌陰轉(zhuǎn)。

2)病灶吸收：(1)顯著吸收：病灶吸收≥1/2原病灶；(2)吸收：病灶吸收<1/2原病灶；(3)不變：病灶無(wú)明顯變化；(4)惡化：病灶擴(kuò)大。吸收率(%)=(顯著吸收例數(shù)+吸收例數(shù))/總例數(shù)×100%。

3)空洞閉合：(1)閉合：空洞閉合或阻塞閉合；(2)縮小：空洞縮小≥原空洞直徑的1/2；(3)不變：空洞縮小或增大<原空洞直徑的1/2；(4)增大：空洞增大>原空洞直徑的1/2。空洞閉合有效率(%)=(閉合例數(shù)+縮小例數(shù))/總例數(shù)×100%。

4)不良反應(yīng)：包含胃腸道不良反應(yīng)、腎功能損傷、肝損傷、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、疲勞等。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、基線資料的比較

76例患者中，根據(jù)吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)結(jié)果分為吡嗪酰胺耐藥(36例，47.4%)和吡嗪酰胺敏感(40例，52.6%)；根據(jù)吡嗪酰胺酶活性檢測(cè)結(jié)果，分為吡嗪酰胺酶陽(yáng)性(32例，42.1%)和吡嗪酰胺酶陰性(44例，57.9%)；吡嗪酰胺藥物敏感性檢測(cè)與吡嗪酰胺酶活性檢測(cè)診斷結(jié)果一致性較高(Kappa=0.687)。吡嗪酰胺酶陽(yáng)性與吡嗪酰胺酶陰性患者基線資料的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床特征在吡嗪酰胺酶陽(yáng)性和陰性患者中的分布情況

二、吡嗪酰胺酶陽(yáng)性與治療結(jié)果的關(guān)系

吡嗪酰胺酶陽(yáng)性患者治療4個(gè)月末病灶吸收率及空洞閉合有效率均高于吡嗪酰胺酶陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；吡嗪酰胺酶陽(yáng)性患者治療6個(gè)月末空洞閉合有效率高于吡嗪酰胺酶陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者在治療2、4及6個(gè)月末痰菌陰轉(zhuǎn)率的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；兩組患者在治療2、4及6個(gè)月末藥物不良反應(yīng)發(fā)生率的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見(jiàn)表2～5。

表2 吡嗪酰胺酶活性與耐多藥肺結(jié)核患者治療后不同時(shí)間點(diǎn)痰菌陰轉(zhuǎn)情況的比較[例(陰轉(zhuǎn)率，%)]

三、藥物不良反應(yīng)發(fā)生情況

吡嗪酰胺酶陽(yáng)性患者在治療2個(gè)月末有3例患者出現(xiàn)藥物性肝損傷，經(jīng)護(hù)肝治療后好轉(zhuǎn)；1例出現(xiàn)尿酸升高，無(wú)關(guān)節(jié)疼痛表現(xiàn)，調(diào)整低尿酸飲食后好轉(zhuǎn)；治療4個(gè)月末有2例患者出現(xiàn)手足末端指關(guān)節(jié)麻木感，考慮為環(huán)絲氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)毒性，加用維生素B6(200 mg/次，3次/d)治療后癥狀好轉(zhuǎn)；治療6個(gè)月末有1例患者出現(xiàn)聽(tīng)力下降，考慮為阿米卡星引起的不良反應(yīng)，在強(qiáng)化期結(jié)束，停用阿米卡星后，患者聽(tīng)力恢復(fù)。

表3 吡嗪酰胺酶活性與耐多藥肺結(jié)核患者治療后不同時(shí)間點(diǎn)病灶吸收情況的比較[例(吸收率，%)]

表4 吡嗪酰胺酶活性與耐多藥肺結(jié)核患者治療后不同時(shí)間點(diǎn)空洞閉合有效情況的比較[例(有效率，%)]

表5 吡嗪酰胺酶活性與耐多藥肺結(jié)核患者治療后不同時(shí)間點(diǎn)不良反應(yīng)發(fā)生情況的比較[例(發(fā)生率，%)]

吡嗪酰胺酶陰性患者在治療2個(gè)月末有1例出現(xiàn)藥物性肝損傷，經(jīng)護(hù)肝治療后好轉(zhuǎn)；2例出現(xiàn)尿酸升高，伴關(guān)節(jié)疼痛表現(xiàn)，給予別嘌呤醇治療后尿酸有所下降；2例出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)，在調(diào)整為餐后服藥后癥狀有所緩解；治療4個(gè)月末有1例患者出現(xiàn)明顯疲乏的癥狀，加用維生素B6治療后癥狀好轉(zhuǎn)；另有1例出現(xiàn)尿酸升高，經(jīng)控制飲食后好轉(zhuǎn)。治療6個(gè)月末有2例患者出現(xiàn)聽(tīng)力下降，停用阿米卡星后聽(tīng)力恢復(fù)；2例患者出現(xiàn)促甲狀腺激素升高，經(jīng)減少丙硫異煙胺用量后，促甲狀腺激素降至正常水平。

討 論

吡嗪酰胺是抗結(jié)核化學(xué)治療的重要藥品，是唯一可在酸性環(huán)境中殺滅半休眠狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的藥品，可縮短抗結(jié)核治療療程。Njire等[6]研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺在原發(fā)性MDR-PTB患者治療的預(yù)后優(yōu)于未使用吡嗪酰胺的患者，且遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率低于未使用吡嗪酰胺的患者。吡嗪酰胺與氟喹諾酮類藥物及異煙肼聯(lián)合使用可提升殺菌活性[7]。WHO于2016年制定的《WHO耐藥結(jié)核病治療指南(2016更新版)》[5]建議，耐多藥結(jié)核病患者治療的強(qiáng)化期至少選用包括吡嗪酰胺和4種核心的二線抗結(jié)核藥品。Shi 等[8]提出，吡嗪酰胺本身并無(wú)抗菌活性，其可被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌內(nèi)，通過(guò)破壞跨膜質(zhì)子濃度，影響膜的能量代謝及膜的運(yùn)輸能力，引發(fā)細(xì)菌死亡。Khan等[9]和Bouzouita等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酸可綁定對(duì)結(jié)核分枝桿菌至關(guān)重要的核糖體蛋白S1(RpsA)，抑制其與tmRNA之間的結(jié)合，阻止DNA編碼蛋白途徑，抑制維系結(jié)核病生存的蛋白，實(shí)現(xiàn)抑菌的功效，吡嗪酰胺耐藥菌株與吡嗪酰胺酶活性喪失密切相關(guān)。因此，吡嗪酰胺酶活性可作為吡嗪酰胺在耐多藥結(jié)核病療效評(píng)估中的重要指標(biāo)。

隨著吡嗪酰胺的廣泛應(yīng)用，其耐藥情況也日漸嚴(yán)重。車洋等[11]對(duì)浙江省寧波地區(qū)的110株耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株吡嗪酰胺耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)耐藥率高達(dá)59.09%，且耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株的吡嗪酰胺耐藥性與鏈霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、左氧氟沙星的耐藥性密切相關(guān)。Yee等[12]對(duì)218例耐多藥結(jié)核病患者進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，單耐吡嗪酰胺治愈率低于全敏感患者，復(fù)發(fā)率及死亡率高于全敏感患者。筆者前期對(duì)120例MDR-PTB患者采用WHO推薦的含吡嗪酰胺的治療方案，截至24個(gè)月的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺敏感的耐多藥結(jié)核病患者的病灶吸收率高于吡嗪酰胺耐藥的患者；吡嗪酰胺敏感的耐多藥結(jié)核病患者的痰菌陰轉(zhuǎn)率高于吡嗪酰胺耐藥的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。

目前，傳統(tǒng)吡嗪酰胺表型藥敏試驗(yàn)存在諸多缺陷，包括檢測(cè)陽(yáng)性率低、檢測(cè)周期長(zhǎng)及不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果一致性較差等。由于對(duì)吡嗪酰胺敏感的結(jié)核分枝桿菌可產(chǎn)生吡嗪酰胺酶，其可將吡嗪酰胺分解為有活性功能的吡嗪酸，而耐吡嗪酰胺者則缺少此酶。因此，測(cè)定吡嗪酰胺酶活性代替吡嗪酰胺藥物敏感性檢測(cè)可能是一種有效的篩選方法，本研究結(jié)果也顯示吡嗪酰胺表型藥敏試驗(yàn)與吡嗪酰胺酶活性檢測(cè)方法的診斷結(jié)果一致性較高。檢測(cè)吡嗪酰胺酶活性的常見(jiàn)方法為Wayne 法，Wayne法陰性被認(rèn)為吡嗪酰胺酶無(wú)活性，結(jié)核分枝桿菌對(duì)吡嗪酰胺耐藥。本研究顯示，吡嗪酰胺酶陽(yáng)性患者在治療4個(gè)月末的病灶吸收率及空洞閉合有效率，以及治療6個(gè)月末的空洞閉合有效率均高于吡嗪酰胺酶陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是兩組患者在治療2、4及6個(gè)月末痰菌陰轉(zhuǎn)率的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。考慮結(jié)核空洞的形成可導(dǎo)致局部低氧環(huán)境及酸性環(huán)境的改變，均可增強(qiáng)吡嗪酰胺的活性，且方案中包含了氟喹諾酮類藥物，吡嗪酰胺與氟喹諾酮類藥物有協(xié)同殺菌作用，可增強(qiáng)療效，研究結(jié)果顯示治療2個(gè)月末吡嗪酰胺酶陽(yáng)性患者的空洞閉合有效率雖較吡嗪酰胺酶陰性患者有所升高，但未達(dá)到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，考慮可能與本研究患者例數(shù)少，且影像學(xué)上吸收改變存在延遲有關(guān)。但總體仍說(shuō)明對(duì)吡嗪酰胺敏感的MDR-PTB患者治療效果優(yōu)于對(duì)吡嗪酰胺耐藥的MDR-PTB患者，與文獻(xiàn)[14-16]的研究結(jié)論較為符合。

本研究的局限性在于，研究樣本量較小，且為非多中心研究，可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚。同時(shí)由于在進(jìn)行此項(xiàng)研究時(shí)，利奈唑胺、貝達(dá)喹啉等藥物在本院未能獲得有效供應(yīng)，因此所采用的是WHO早先提出的耐多藥結(jié)核病治療方案，而非近年的治療方案。對(duì)吡嗪酰胺酶活性檢測(cè)法為生化顯色反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果的判讀會(huì)存在主觀性誤判的可能，且吡嗪酰胺酶活性檢測(cè)法要求檢測(cè)樣本新鮮和樣本量大，如樣本不符合要求可能會(huì)導(dǎo)致無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，從而導(dǎo)致結(jié)果的誤判。此外，由于研究時(shí)間較短，本研究中MDR-PTB患者療效均為強(qiáng)化期后進(jìn)行的評(píng)估，未納入鞏固期療效數(shù)據(jù)，吡嗪酰胺敏感性及吡嗪酰胺酶活性對(duì)遠(yuǎn)期療效的影響值得進(jìn)一步探討。吡嗪酰胺耐藥性與pncA基因突變關(guān)聯(lián)密切[17-19]，但是吡嗪酰胺酶活性與pncA基因突變的關(guān)聯(lián)尚未明確，本研究并未對(duì)全部患者的耐藥菌株進(jìn)行基因檢測(cè)，故上述基因誘發(fā)吡嗪酰胺酶活性的確切關(guān)聯(lián)還要留待后續(xù)研究加以明確。