抗結核藥物組合藥效篩選研究進展

劉海婷 陸宇

2019年全球新發1000萬例結核病患者，我國仍是結核病高負擔國家之一[1]。雖然我國藥物敏感結核病的治愈率達93%[2]，但在耐藥結核病患者不斷增多的情況下，結核病的臨床治療變得越來越復雜。為降低單藥治療對細菌耐藥性產生的風險，增大臨床治愈的可能性，臨床迫切需要有新作用機制的抗結核藥物和高效的藥物組合方案來最大限度地減少細菌負荷，提高治療效果，縮短療程。盡管普遍認為抗結核藥物組合是治療結核病的一個潛在工具[3]，但并不是任意的藥物組合都對結核病的治療有效，這需要通過體內外篩選實驗來獲得具有高活性的藥物組合。筆者對近年來抗結核藥物組合及體內外篩選方法進行綜述，以期為Ⅱb期臨床新方案的選擇提供參考。

一、體外篩選法

體外篩選法在抗結核藥物組合的研究中極其重要，常見的有棋盤法和時間-殺傷動力學分析法?？捎糜谠u估多種不同作用機制藥物組合的體外抗結核活性，為更復雜的表型研究或體內實驗的后續評估提供依據[4]。

(一)棋盤法

棋盤法是一種基于肉湯培養基中藥物最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測定的方法，可以用來評估藥物對細菌的抑制作用[5]，適合2種或3種藥物組合的活性篩選，應用非常廣泛。棋盤法包括瓊脂棋盤稀釋法、試管棋盤稀釋法和微量棋盤稀釋法，又以后者為最常見的聯合藥物敏感性試驗方法[6]，該方法在96孔板內進行，各藥物的二倍稀釋液分別加入到棋盤的水平方向和垂直方向，一般取6～8個濃度梯度[7]，并設置陽性對照孔和陰性對照孔，通過觀察還原(顏色從藍色變為紫色或粉色，表示有細菌生長)或不還原(藍色，表示由于藥物的抑制而沒有細菌生長)的顏色變化直觀地讀取細菌生長情況，進而確定聯合用藥中每種藥物的MIC[8]。組合作用是通過計算部分抑制濃度(fractional inhibitory concentration，FIC)來確定的。目前，較為公認的FIC法是通過計算棋盤中藥物阻止孔的顏色從藍色變為紫色或者粉紅色時的最低FIC值[9]。

對于二維棋盤法，FIC=(MICA+B/MICA)+(MICB+A/MICB)，其中，MICA和MICB分別表示A藥和B藥單獨作用于結核分枝桿菌時的MIC，MICA+B和MICB+A分別表示A藥和B藥聯合作用后，達到相同藥效時對應的A藥和B藥的MIC。當FIC≤0.5時，兩藥為協同作用(定義為兩藥聯合用藥的MIC比單獨用藥降低4倍或更大)；當0.5

(二)時間-殺傷動力學分析法

時間-殺傷動力學分析法被認為是確定抗菌劑間藥物協同作用的標準參考方法，分為靜態時間殺傷法模型和動態藥動學/藥效學(PK/PD)模型。該方法可以通過在包含各種抗菌劑的肉湯中添加標準接種物來實現，從含有抗菌劑的肉湯中以不同的時間間隔進行傳代培養，通過連續采樣來量化細菌負荷隨時間的變化。藥物的協同作用定義為：與單一藥物最好的療效相比，聯合用藥作用后活菌數減少量≥2 log10菌落形成單位(CFU)/ml被認為是協同作用，1 log10 CFU/ml≤減少量≤2 log10 CFU/ml被認為是加性的，減少量≤1 log10 CFU/ml被認為是無關作用，而活菌數增加量≥2 log10 CFU/ml被認為是拮抗作用[12]。

1.靜態時間殺傷法：是將細菌在含藥物組合的液體培養管中進行培養，在間隔時間點從每個試管中取出一定量的液體進行菌落計數的方法。其模型是評估細菌對藥物濃度隨時間固定的反應，且能同時對多種藥物的抗菌效果進行評估。衡量標準包括CFU計數或替代物。

2.動態PK/PD模型法：動態PK/PD模型又稱中空纖維系統(hollow fibersystem，HFS)模型，是一種常用的擴散模型，于1972年由Knazek等[13]提出。因其可承受更高的細菌負荷，已成為一種動態評估藥物對細菌作用的方法[14]，并被歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)鑒定為一種用于支持抗結核治療方案選擇和開發的方法[15]。該模型以不同時間間隔從外圍隔室進行采樣的方式，獲得量化的藥物濃度和細菌計數。雖然HFS模型在抗結核藥物的研究中應用很廣，但也具有一定的局限性，如HFS-TB不能解釋藥物與血漿蛋白的潛在結合，也不能在宿主的防御下或其他可能出現的復雜結節性病變的情況下解釋抗菌功效[16-17]。

二、體內篩選法

經體外篩選獲得的有效抗結核藥物組合方案通常要在機體內進行藥物組合療效的進一步驗證，通常包括動物模型法和臨床試驗法。

(一)動物模型法

在抗結核新藥和疫苗的研發過程中，動物模型一直是其關鍵組成部分[18-20]?？菇Y核新藥的研究可以在豚鼠、小鼠、兔子和非人靈長類等不同動物模型中展開，但進行藥效評價的方法有所差異。例如，鼠和兔作為動物模型時，主要通過菌落計數的下降和停止治療后沒有復發來判定治療有效[21]；而對于非人靈長類動物來說，不僅可以采用菌落計數，還可以根據氟代脫氧葡萄糖正電子發射計算機斷層掃描顯像技術(FDG PET-CT)的方法來判定藥物的療效[22]。但由于遺傳性、安全性和倫理學的限制，近年來抗結核藥物組合療效的研究模型主要為小鼠和豚鼠模型。

小鼠是抗結核藥物組合研究中最常用的動物模型，具有體積相對較小和成本較低的優點，是藥物組合研究中的最佳選擇。在常用的小鼠模型(如BALB/c和C57BL/6)中，結核分枝桿菌主要侵襲小鼠肺部，但僅發展為肺部炎性而非壞死性病變，與人類結核病和其他動物模型相反；而C3HeB/FeJ小鼠模型感染結核分枝桿菌后，其肺部發生病變的病理與人類接近。有研究發現，肺部病理的不同可能會影響藥物的分布，從而影響藥物的療效，如Irwin等[23]在BALB/c和C3HeB/FeJ小鼠模型中檢測了貝達喹啉和吡嗪酰胺單獨和聯合給藥時的治療反應，發現BALB/c小鼠對兩種藥品均表現出高度一致的治療反應，而C3HeB/FeJ小鼠則表現出對藥品敏感和不敏感的雙峰反應結果。

豚鼠是結核病研究中另一個重要的動物模型。與小鼠不同，豚鼠對結核分枝桿菌具有高度的敏感性，在其感染結核分枝桿菌后會發生與人類結核病病理相似的干酪樣壞死。雖然豚鼠已成為證明鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇抗結核活性的實驗性化療動物模型的較優選擇，但其作為實驗性化療模型的特性仍然很差，且成本較高，仍然不是藥物組合研究中的最佳選擇。從臨床菌株中觀察到，某些新出現的臨床分離株在小鼠體內的生長要好于豚鼠，因而，結核病模型的建立在小鼠中容易實現；其次，盡管豚鼠的肺部有大面積壞死病變，但它們仍能存活很長一段時間[24]，這將影響藥物療效的評估。

(二)臨床試驗法

臨床試驗法在抗結核藥物組合的篩選中占據了重要的地位，許多藥物組合方案經過一系列的體外抗結核活性篩選，即可作為臨床前推進藥物在動物體內進行藥效評估。然而，任何一種體外模型和動物模型都不能真實反映藥物對人體的作用，還需進行藥物在人體中安全性和有效性的評估。

抗結核藥物臨床試驗分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期，其中Ⅰ期試驗主要是評價藥物的安全性；Ⅱ期試驗旨在研究抗結核藥物的早期殺菌活性(early bactericidal activity，EBA)?？菇Y核藥物早期殺菌活性的測定是一種快速評估抗結核新藥和藥物組合有效性的方法[25-26]，通過檢測患者抗結核治療早期痰中活的結核分枝桿菌CFU的下降，來確定藥物殺死涂陽肺結核患者痰中活菌的能力，通常計算治療前14 d CFU計數的下降率[27]。但EBA的臨床研究也有其局限性，既無法評估藥物對休眠結核分枝桿菌的活性，也無法確定單一藥物對其聯合作用的相對貢獻[28]。關鍵Ⅲ期臨床試驗的主要評價終點是治療6個月后痰培養陽性患者的比例和2年隨訪期內復發患者的比例，其中治療2個月后的痰培養狀態(“陽性”或“陰性”)被認為是結核病終點主要療效的潛在替代指標。

三、抗結核藥物組合新方案

目前，有14種抗結核新藥處于臨床試驗階段，已有8種抗結核藥品用于治療藥物敏感結核病，18種用于耐藥結核病，還有8種用于結核分枝桿菌潛伏感染(LTBI)者的預防性治療方案處于臨床試驗階段[29]。

(一)藥物敏感結核病

隨著新藥的開發及藥物的重新使用，一些新的藥物方案逐步走向臨床，旨在縮短和簡化藥物敏感結核病的治療方案，以提高患者依從性。

在小鼠結核病模型研究中發現含大劑量利福平的方案可明顯縮短藥物敏感結核病的治療時間[30-31]，在BALB/c小鼠結核病模型中，增加利福霉素類藥物的暴露，特別是用每日高劑量利福噴丁代替利福平，可以明顯縮短無復發和治愈所需的治療時間[32-34]。而在藥物敏感結核病治療的Ⅱ期臨床試驗(NCT00694629)中發現，較高的利福噴丁暴露與較高的殺菌活性密切相關，且目前正在進行一項確定高劑量的利福噴丁替代利福平是否可以將藥物敏感結核病的治療時間縮短至4個月的Ⅲ期臨床試驗(NCT02410772)。而在前期對BALB/c小鼠模型的研究中，比較了在6個月的標準抗結核方案中加入氯法齊明與6個月的標準抗結核方案的抗結核活性，發現含有氯法齊明的方案具有顯著的抗結核活性，且可將治愈患者的療程縮短2個月[35-36]。目前Ⅱ/Ⅲ期 TRUNCATE-TB研究(NCT03474198)正在評估將氯法齊明添加到一線抗結核方案中的療效。關于優化使用經批準的藥品并改進配方和藥片數量的研究也在進行中。在一個多臂多階段(multi-arm multi-stage，MAMS)試驗PanACEA (NCT01785186)研究中，調查了利福平(分別為20 mg/kg和35 mg/kg)聯合莫西沙星和SQ109與含10 mg/kg 利福平的標準方案對肺結核患者的療效，發現含35 mg/kg 的利福平是安全的，且在8周培養陰轉的時間短于含20 mg/kg 和10 mg/kg 利福平的方案，可能縮短結核病的治療時間[37]。

(二)耐藥結核病

目前，WHO推薦的常規耐多藥結核病的治療方案復雜、時間長(至少20個月)、費用高、耐受性差。隨著人們對結核分枝桿菌耐藥性認識的不斷加深，人們越來越認識到重新利用藥物[如利奈唑胺(Lzd)和氯法齊明]和新藥[如貝達喹啉(Bdq)和德拉馬尼]有著重要的作用。

近年來，出現了許多旨在解決耐多藥結核病的新療法。2016年，WHO通過的一項為期9～11個月的Bangladesh方案[38][強化期為4～6個月的卡那霉素、加替沙星、丙硫異煙胺、氯法齊明、吡嗪酰胺(PZA)、高劑量異煙肼和乙胺丁醇，鞏固期為5個月的加替沙星、氯法齊明、吡嗪酰胺和乙胺丁醇]被證明對耐多藥結核病患者有效。在小鼠結核病模型研究中發現含普瑞瑪尼(PA-824)、莫西沙星(Mfx)和吡嗪酰胺的新方案(Pa-M-Z)具有優于當前一線R-H-Z方案(R：利福平，H：異煙肼，Z：吡嗪酰胺)的殺菌活性[39-40]，隨后的一項隨機對照Ⅱ期臨床研究NC-002試驗(NCT01498419)證實了Pa-M-Z方案的有效性，表明這種新方案的EBA不亞于標準抗結核藥品[41]，之后在小鼠結核病模型中發現，將貝達喹啉和普瑞瑪尼與利奈唑胺(B-Pa-L方案)或莫西沙星和吡嗪酰胺(B-Pa-M-Z方案)聯合的新方案可明顯縮短抗結核療程，并在初步臨床試驗中取得了盡如所期的結果；且與標準方案相比，B-Pa-M-Z方案具有更好的殺菌活性，可將預防復發所需的治療持續時間縮短2.5～3.5個月[42]。在隨后的第2階段NC-005試驗(NCT02193776)中，接受B-Pa-M-Z方案治療的吡嗪酰胺易感的耐多藥結核病患者的痰培養陰轉率明顯快于接受標準方案治療的藥物敏感結核病患者[43]；同樣，與小鼠結核病模型研究中的標準方案相比，B-Pa-L方案也具有較好的殺菌活性[44]，雖然B-Pa-L方案不能如B-Pa-M-Z方案那樣快速治愈小鼠，但其具有更廣的活性范圍。在隨后的NiX-TB試驗(NCT02333799)中評估了為期6個月的貝達喹啉聯合普瑞瑪尼和利奈唑胺(600 mg/次，2次/d)的方案，發現無復發患者的比例達到了87%[45]。最近，一項針對耐藥結核病的end TB試驗(NCT03259269)評估了含貝達喹啉和德拉馬尼新方案的安全性和有效性[46]。

四、總結與展望

新藥物組合方案需經過體外和體內篩選才能應用于臨床，而評價藥物組合抗結核活性的實驗方法是將其應用于臨床前的前期藥效篩選的一個重要手段，它不僅能實現大規模組合活性篩選的測定，還能節約大量的實驗時間和成本。目前，體外抗結核藥物組合藥效篩選方法多種多樣，但尚缺乏標準化的評價標準，仍需進一步完善。幸運的是，隨著一些新技術的發展，尤其是計算機技術與數學模型的引入，為抗結核藥物的藥效篩選提供了新的方向。