miR-199a在妊娠糖尿病中的表達(dá)及參與胰島素抵抗的作用機(jī)制研究

馬雙玲，李國蕓△，楊穎，李辭妹，周芳芳，張新寧，王茜

妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）指妊娠期發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的糖耐量異常現(xiàn)象，是妊娠期最常見的內(nèi)科綜合征。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為GDM的發(fā)生與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）關(guān)系密切［1］。微小RNA（miRNA，miR）可通過調(diào)控胰島素合成、分泌、信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，從而影響GDM進(jìn)程［2］。研究顯示，敲低miR-199a會(huì)導(dǎo)致肝臟葡萄糖耐量和清除率降低，miR-199a在IR中發(fā)揮重要作用［3］。沉 默 信 息 調(diào) 節(jié) 因 子1（silent mating type information regulator 2 homolog 1，SIRT1）∕叉頭盒轉(zhuǎn)錄 因 子O1（forkhead box transcription factor O1，F(xiàn)OXO1）被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，可直接調(diào)控胰島素敏感性［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a與SIRT1存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-199a靶向SIRT1后能減輕膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷［5］。目前，有關(guān)miR-199a在GDM中的作用及其與IR的關(guān)系鮮有報(bào)道，本研究就此進(jìn)行探討。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年10月—2020年10月于新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院分娩的GDM孕婦（GDM組）56例為研究對(duì)象，年齡23～35歲，平均（28.16±2.61）歲；孕周37～40周，平均（38.35±1.16）周；收縮壓92～128 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），平均（107.65±11.24）mmHg，舒張壓56～89 mmHg，平均（74.32±8.37）mmHg。GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》［6］。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)。（2）資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在死胎兒或巨型胎兒史者。（2）心、肝、腎器官存在重大疾病者。（3）多囊卵巢綜合征者。（4）服用激素等干擾糖代謝藥物者。（5）有妊娠合并癥及并發(fā)癥家族史者。選擇同期正常孕婦60例為正常孕婦組，年齡23～35歲，平均（28.35±2.46）歲；孕周37～41周，平均（38.43±1.23）周；收縮壓93～123 mmHg，平均（108.36±10.69）mmHg，舒張壓62～86 mmHg，平均（73.47±5.89）mmHg。2組年齡（t=0.404）、孕周（t=0.360）、舒張壓（t=0.349）、收縮壓（t=0.636）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院倫理協(xié)會(huì)審核并通過，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8∕SVneo（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）；棕櫚酸、胰島素（美國Sigma公司），miRNA inhibitor NC、miR-199ainhibitor、miRNA mimic NC、miR-199amimic、引物（廣州銳博生物科技有限公司）；蒽酮（上海麥克林生化科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）檢測試劑盒及SIRT1、FOXO1、乙酰化FOXO1（Ac-FOXO1）、GAPDH一抗及羊抗兔二抗（英國Abcam公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（碧云天生物科技有限公司）。全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)：URIT-8021A；武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司）；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：Tocan240；上海領(lǐng)成生物科技有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀（型號(hào)：VERITI；美國ABI公司）。

1.3 胎盤miR-199a及空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）檢測

1.3.1 qPCR檢測胎盤中miR-199a水平 取孕婦分娩時(shí)新生兒胎盤，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR儀檢測miR-199a水平。miR-199a引物：上游5'-ACACTCCAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3'；下 游5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6引物：上游5'-CTAGCTTCGGCAGCACA-3'；下 游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。反應(yīng)體系：2×Taq PCR混合液10μL、cDNA（50μg∕L）1μL、上下游引物各0.5μL、ddH2O 8μL。反應(yīng)條件：95℃90 s；95℃30 s，59℃50 s，40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算miR-199a相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2 FBG、FINS檢測 孕婦分娩前取肘正中靜脈血5 mL，全自動(dòng)生化分析儀檢測FBG，放射免疫法檢測FINS，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FBG（mmol∕L）×FINS（mU∕L）∕22.5。

1.4miR-199a對(duì)細(xì)胞功能的影響

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及IR模型制作 HTR-8∕SVneo細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。棕櫚酸0.027 g溶于0.1 mol∕L NaOH，70℃水浴配成1 mmol∕L母液待用；蒸餾水將胰島素配制成10 mmol∕L母液，100倍稀釋待用。參考文獻(xiàn)［7］，依細(xì)胞處理方式不同分為對(duì)照組、棕櫚酸組（250μmol∕L棕櫚酸）、胰島素組（0.25μmol∕L胰島素）、模型組（250μmol∕L棕櫚酸+0.25μmol∕L胰島素），24 h后檢測各組糖吸收情況。棕櫚酸、胰島素共同作用細(xì)胞24 h建立IR模型后將IR細(xì)胞再分為模型組、miRNA inhibitor NC組、miR-199ainhibitor組、miRNA mimic NC組、miR-199amimic組，除模型組外，其余各組以10μL Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染4μg的miRNA inhibitor NC、miR-199ainhibitor、miRNA mimic NC及miR-199amimic，培養(yǎng)4～6 h，更換完全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.2 qPCR檢測細(xì)胞中miR-199a水平 按1.3.1中對(duì)應(yīng)步驟檢測細(xì)胞中miR-199a水平。

1.4.3 蒽酮法測定細(xì)胞內(nèi)葡萄糖吸收量 參照文獻(xiàn)［8］，葡萄糖水解成單體后與硫酸蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色產(chǎn)物，采用分光光度儀在620 nm波長處檢測吸光度（A620）值變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葡萄糖含量；葡萄糖吸收量=培養(yǎng)基葡萄糖含量-所測葡萄糖含量。

1.4.4 上清液中SOD、MDA水平檢測 細(xì)胞培養(yǎng)后收集培養(yǎng)液，500 r∕min離心5 min，收集上清液，上清液嚴(yán)格按照SOD活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒步驟進(jìn)行。酶標(biāo)儀檢測SOD、MDA水平。

1.4.5 Western blot檢測細(xì)胞中SIRT1∕FOXO1通路SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白表達(dá)水平 蛋白裂解液冰上裂解細(xì)胞，4℃14000 r∕min離心20 min，上清液為總蛋白。凝膠電泳分離蛋白、NC膜轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對(duì)應(yīng)加入一抗SIRT1（1∶1000）、FOXO1（1∶2000）、Ac-FOXO1（1∶2000）、GAPDH（1∶5000），4℃孵育過夜；加入對(duì)應(yīng)二抗（1∶5000），室溫孵育1 h；DAB顯色試劑盒避光顯色，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)拍照和定量分析。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)鑒定miR-199a與SIRT1的靶向關(guān)系 在線軟件Starbase（http:∕∕carolina.imis.athena-innovation.gr∕）分析SIRT1序列上是否存在miR-199a潛在結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建含miR-199a潛在結(jié)合位點(diǎn)的野生型載體（SIRT1 WT）和對(duì)應(yīng)突變型載體（SIRT1 MUT）。將SIRT1 WT、SIRT1 MUT質(zhì)粒載體分別與miR-199amimic、miRNA mimic NC共轉(zhuǎn)染HTR-8∕SVneo細(xì)胞。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶相對(duì)活性，驗(yàn)證miR-199a與SIRT1的靶向關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GDM組和正常孕婦組胎盤中miR-199a和HOMA-IR比較 GDM組較正常孕婦組胎盤中miR-199a相對(duì)表達(dá)水平以及HOMA-IR升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of miR-199a and HOMA-IR in the placenta between the two groups表1 2組胎盤中miR-199a和HOMA-IR比較（±s）

Tab.1 Comparison of miR-199a and HOMA-IR in the placenta between the two groups表1 2組胎盤中miR-199a和HOMA-IR比較（±s）

**P＜0.01

組別正常孕婦組GDM組t n 6056胎盤miR-199a 1.01±0.123.46±0.5931.485**HOMA-IR 5.96±0.9826.48±8.4818.617**

2.2 GDM患者miR-199a水平與HOMA-IR的相關(guān)性 GDM患者胎盤中miR-199a與HOMA-IR水平呈正相關(guān)（r=0.501，P＜0.05）。

2.3 IR模型驗(yàn)證 對(duì)照組、棕櫚酸組、胰島素組及模型組葡萄糖吸收量（mg）分別為2.19±0.17、3.69±0.17、3.72±0.13、1.85±0.07，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.546，P＜0.05）。與對(duì)照組比較，棕櫚酸組和胰島素組葡萄糖吸收量升高，模型組葡萄糖吸收量降低（P＜0.05），模型組較棕櫚酸組、胰島素組葡萄糖吸收量降低（P＜0.05）。

2.4 各組miR-199a水平、葡萄糖吸收量及上清液中SOD、MDA水平比較 與模型組和miRNA inhibitor NC組比較，miR-199ainhibitor組細(xì)胞中葡萄糖吸收量及上清液中SOD水平升高，miR-199a水平、上清液中MDA水平降低（P＜0.05）。與模型組和miRNA mimic NC組比較，miR-199amimic組細(xì)胞中葡萄糖吸收量降低，miR-199a水平、上清液中MDA水平升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of miR-199a level,glucose uptake,SOD and MDA levels in supernatant between 5 groups of cells表2 5組細(xì)胞中miR-199a水平、葡萄糖吸收量及上清液SOD、MDA水平比較 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of miR-199a level,glucose uptake,SOD and MDA levels in supernatant between 5 groups of cells表2 5組細(xì)胞中miR-199a水平、葡萄糖吸收量及上清液SOD、MDA水平比較 （n=6，±s）

**P＜0.01；a與模型組比較，b與miRNA inhibitor NC組比較，c與miRNA mimic NC組比較，P＜0.05

組別模型組miRNA inhibitor NC組miR-199a inhibitor組miRNA mimic NC組miR-199a mimic組F miR-199a 0.96±0.091.01±0.120.36±0.03ab 1.03±0.131.86±0.22ac 16.095**葡萄糖吸收量（mg）2.41±0.162.39±0.083.95±0.11ab 2.42±0.111.13±0.08ac 79.832**SOD（U∕mL）248.49±15.91253.58±45.85386.85±38.94ab 247.95±18.45169.48±25.44c 6.327**MDA（μmol∕L）5.96±0.856.05±0.483.16±0.12ab 5.89±0.539.15±0.48ac 15.213**

2.5 各組SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 各組FOXO1蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組和miRNA inhibitor NC組比較，miR-199ainhibitor組SIRT1相對(duì)表達(dá)水平升高。與模型組和miRNA mimic NC組比較，miR-199amimic組SIRT1相對(duì)表達(dá)水平降低、Ac-FOXO1相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05），見圖1、表3。

Fig.1 Changes of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein detected by Western blot assay圖1 Western blot法檢測SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白變化

Tab.3 Protein levels of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 in the 5 groups of cells表3 5組細(xì)胞中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平（n=6，±s）

Tab.3 Protein levels of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 in the 5 groups of cells表3 5組細(xì)胞中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平（n=6，±s）

**P＜0.01；a與模型組比較，b與miRNA inhibitor NC組比較，c與miRNA mimic NC組比較，P＜0.05

組別模型組miRNA inhibitor NC組miR-199a inhibitor組miRNA mimic NC組miR-199a mimic組F SIRT11.56±0.121.62±0.082.54±0.14ab 1.53±0.110.84±0.12ac 27.401**FOXO10.46±0.090.41±0.040.47±0.050.50±0.060.49±0.050.527 Ac-FOXO15.96±0.856.05±0.483.86±0.125.89±0.539.15±0.48ac 12.134**

2.6miR-199a與SIRT1的靶向關(guān)系驗(yàn)證 Tarbase數(shù)據(jù)庫分析顯示，miR-199a與SIRT1存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。miR-199amimic+SIRT1 WT組、miRNA mimic NC+SIRT1 WT組、miR-199amimic+SIRT1 MUT組、miRNA mimic NC+SIRT1 MUT組熒光素酶相對(duì)活性分別為（0.47±0.06）、（1.01±0.09）、（0.99±0.08）、（1.00±0.09）。與miRNA mimic NC+SIRT1 WT組比較，miR-199amimic+SIRT1 WT組熒光 素 酶 相 對(duì) 活 性 降 低（t=12.229，P＜0.05）；與miRNA mimic NC+SIRT1 MUT組比較，miR-199amimic+SIRT1 MUT組熒光素酶相對(duì)活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.203，P＞0.05）。

Fig.2 Verification of the targeting relationship between miR-199a and SIRT1圖2 miR-199a與SIRT1靶向關(guān)系的驗(yàn)證

3 討論

GDM患者發(fā)生IR會(huì)影響外周組織對(duì)葡萄糖的攝取，當(dāng)IR發(fā)生時(shí)導(dǎo)致胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用效率降低，機(jī)體代償性分泌過多胰島素以維持血糖穩(wěn)定，改善IR能部分提高葡萄糖在體內(nèi)攝取率，從而緩解疾病［9-10］。因此，改善IR對(duì)GDM意義重大。

miRNA在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)和糖尿病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。miR-199a在人體中廣泛存在，可通過調(diào)控多種信號(hào)通路并影響氧化應(yīng)激等［11］。miR-199a參與脂肪分化、IR、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞周期調(diào)控和能量代謝過程［12］。在IR的小鼠血清微陣列芯片檢測中發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，miR-199a在IR小鼠血清中呈高表達(dá)，推測miR-199a參與糖尿病和IR的發(fā)生過程［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常孕婦相比，GDM患者胎盤中miR-199a水平、HOMA-IR升高，提示GDM患者存在miR-199a表達(dá)異常和IR。相關(guān)性分析顯示，GDM患者miR-199a與HOMA-IR呈正相關(guān)，提示miR-199a與IR的發(fā)生存在一定關(guān)系。單獨(dú)用棕櫚酸、胰島素處理后，細(xì)胞中葡萄糖吸收量均升高，提示無論是單獨(dú)添加棕櫚酸還是胰島素均可促進(jìn)葡萄糖吸收；但棕櫚酸與胰島素聯(lián)合處理后葡萄糖的吸收量降低，表明兩者協(xié)同作用時(shí)發(fā)生了IR。與模型組相比，miR-199ainhibitor組細(xì)胞中miR-199a降低、miR-199amimic組細(xì)胞中miR-199a升高，提示miR-199ainhibitor和mimic轉(zhuǎn)染成功。而降低miR-199a后細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收量增加，提示降低miR-199a后細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性增加，導(dǎo)致葡萄糖吸收增強(qiáng)，增加miR-199a后細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收降低，IR作用增強(qiáng)。

SIRT1是一類進(jìn)化上高度保守的蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過程，參與各種代謝和病理生理過程［15］。SIRT1調(diào)節(jié)葡萄糖和胰島素分泌過程，當(dāng)血糖水平升高時(shí)，Sirt1可促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，從而血糖維持在正常水平［16］。SIRT1亦可通過調(diào)控FOXO1乙酰化水平發(fā)揮作用［17］。FOXO1是胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵下游分子，可調(diào)節(jié)糖代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等，從而參與IR過程［18］。降低SIRT1可使FOXO1乙?；蟮幕钚栽鰪?qiáng)，引起細(xì)胞損傷嚴(yán)重、凋亡增加，進(jìn)而增強(qiáng)IR［19-20］。SOD反映機(jī)體清除氧自由基水平，MDA可反映機(jī)體過氧化程度和細(xì)胞損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，miR-199ainhibitor組SIRT1相對(duì)表達(dá)水平升高，miR-199amimic組SIRT1相對(duì)表達(dá)水平降低、Ac-FOXO1相對(duì)表達(dá)水平升高。以上結(jié)果表明，miR-199a表達(dá)降低后促進(jìn)SIRT1表達(dá)，抑制FOXO1乙酰化，降低上清液中MDA水平，促使細(xì)胞清除機(jī)體內(nèi)氧自由基，促進(jìn)葡萄糖吸收，從而提高細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，降低IR，而miR-199a表達(dá)升高后則表現(xiàn)出相反的作用。

綜上所述，miR-199a在GDM患者胎盤中高表達(dá)，且與IR關(guān)系密切，升高miR-199a可通過靶向下調(diào)SIRT1而促進(jìn)FOXO1乙?；龠M(jìn)IR，但miR-199a靶基因眾多，是否還存在別的通路發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究。