探究四種蘭科植物的繁殖能力及培育方法

韓萱

（北京中學，北京 100018）

1 研究背景

西雙版納是我國現(xiàn)存面積最大的熱帶雨林地區(qū)，它位于中國云南省南部，地處北回歸線以南的熱帶北部邊沿，受印度洋、太平洋季風氣候影響，終年溫暖、陽光充足、濕潤多雨，是中國熱帶雨林生態(tài)系統(tǒng)保存最完整、最典型的地區(qū)，也是當今地球上少有的植物基因庫，被譽為地球的一大自然奇觀，是一個豐富多彩的“植物王國”。

蘭科植物藥用價值高，但對生長環(huán)境要求苛刻，加之人們肆意破壞，現(xiàn)已成為瀕危物種。蘭科植物種類繁多，大多數(shù)的蘭花樣品屬于石斛屬，許多種類均是名貴的中藥材。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，“石斛”被列為上品，因此已造成掠奪性采挖，加上對生長環(huán)境要求苛刻，繁殖緩慢，自然更新能力差，而且僅在我國云南和廣西有大范圍的種植和栽培。

隨著人們保護環(huán)境、保護生物多樣性、保護瀕危物種意識的提高，蘭科植物的繁殖和栽培也已引起人們的重視，研究人員也在積極的探尋一種加快蘭科植物繁殖、改善其種植環(huán)境的新方法。蘭花喜濕潤，忌漬澇。盆土水分過大，喜涼爽，忌高溫，喜陰，忌陽光直射。

為了能培育蘭科植物并回歸自然，減少人力和財力的消耗，我們將通過使用TTC 染色法對選擇的金釵石斛、竹枝石斛、鼓槌石斛、冬鳳蘭等四種常見的蘭科植物種子的活力進行測定并選擇活力較高的蘭科植物種類進行培育，從而探究四種蘭科植物的繁殖能力和種植方法。希望能夠通過我們的研究加快培養(yǎng)蘭科植物的生長速度。

2 研究目的

（1）了解真菌對蘭科植物萌發(fā)的影響；

（2）探究四種蘭科植物種子的繁殖能力及培育方法；

（3）提出合理科學地選擇并培育蘭科植物的建議。

3 研究方法

3.1 工具及儀器

潔凈工作臺、電熱鼓風干燥箱、立式壓力蒸汽滅菌器、顯微鏡、計數(shù)器、電子天平、電磁爐試、注射器、無紡布、載玻片、蓋玻片、蘭花瓶、鍋、純凈水、pH 試紙、玻璃棒、量筒、燒杯、培養(yǎng)皿、錐形瓶等。

3.2 材料及藥品

金釵石斛、竹枝石斛、鼓槌石斛和冬鳳蘭四種蘭科植物成熟種子、已萌發(fā)蘭科植物幼苗、蘭科植物菌根菌、TTC、4%次氯酸鈣溶液、1%吐溫80 溶液、純凈水、MS 母液、蔗糖、瓊脂、活性炭、土豆、葡萄糖、瓊脂。

3.3 實驗步驟

3.3.1 種子預處理

將從野外采集回來的種子放在干燥器里，去除種子表面的水分后裝進收集管內(nèi)密封，并放入4℃冰箱保存。

3.3.2 TTC 染色法測定蘭花種子活力

將注射器頂端用45μm 孔徑的紗布封住，防止種子出來；將少許經(jīng)過預處理的蘭科植物種子放入注射器針管；將4%的次氯酸鈣和1%吐溫801:1 混合，用玻璃棒攪拌充分混合；用注射器抽進7mL 混合液，排出空氣，振蕩均勻，靜置20min；排出混合液，抽進純凈水，搖晃注射器，再排出純凈水，反復三次清洗；抽進7～8mL 純凈水，放到陰涼處靜置24h；將注射器中的純凈水排出，將少許TTC 倒進小燒杯內(nèi)，用注射器吸入5～6mL，放入30℃電熱鼓風干燥箱，靜置24h；染色畢，排出TTC，吸入至少6mL 的純凈水，振蕩注射器，排出純凈水反復三次，最后一次留下少許純凈水。

3.3.3 真菌培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）的配置與菌根菌的培養(yǎng)

準備200g 左右的土豆一塊，洗凈、削皮、切塊，開水煮30min；同時各量出20g 的葡萄糖和瓊脂，準備培養(yǎng)皿，并使用滅菌鍋消毒；將土豆塊撈出，留下剩余液體，用四層紗布過濾至燒杯中，再用四層紗布將液體過濾到最大測量值大于等于1L 的量筒中，補充純凈水至1L；從量筒中倒出一部分液體與瓊脂混合，攪拌至糊狀。加入葡萄糖、瓊脂糊，加熱；將液體培養(yǎng)基分別倒入四個錐形瓶250mL，封口，用滅菌鍋滅菌；用超凈工作臺給培養(yǎng)皿紫外線滅菌，點燃酒精燈，將蘭花培養(yǎng)基從滅菌鍋中取出，用酒精燈加熱錐形瓶瓶口消毒，將液體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，厚度為4mm 左右，以此類推，直至加工完所有液體培養(yǎng)基。等待所有PDA 培養(yǎng)基冷卻凝固；用酒精燈加熱接種針消毒，直至燒紅，靜置冷卻。用接種針剜下一小塊蘭花的菌根菌，放到培養(yǎng)皿正中間；合閉培養(yǎng)皿，加熱邊緣消毒，用保鮮膜包裹2～3 圈，以此類推，加工完所有培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱，等待萌發(fā)。

3.3.4 蘭花培養(yǎng)基（MS 培養(yǎng)基）的配制與蘭花苗的移植

加入工作液：大量元素、氯化鈣水各200mL，微量元素、有機元素、鐵鹽各加10mL；純凈水定容至2L，煮沸。添加蔗糖50g、瓊脂16g、黑炭2g，攪拌均勻，煮沸；將液態(tài)培養(yǎng)基分別倒入32 個培養(yǎng)罐內(nèi)，深度在1cm 左右。等待培養(yǎng)基冷卻、凝固；將蘭花培養(yǎng)基放入超凈工作臺半小時紫外線滅菌。將鑷子放入327℃左右的接種器械滅菌器滅菌，取出長滿石斛幼苗的培養(yǎng)罐兩個；點燃酒精燈，用酒精燈加熱培養(yǎng)罐與MS 培養(yǎng)基罐罐口滅菌，并打開罐蓋；加熱鑷子消毒，再將鑷子插入MS 培養(yǎng)基冷卻；用鑷子輕輕將石斛苗夾入MS 培養(yǎng)基，生長點朝下，葉子朝上，每個MS 培養(yǎng)基罐放入4 個左右的苗，以此類推，移植到全部32 個培養(yǎng)罐內(nèi)；操作完成后，鑷子用75%的酒精消毒后放回接種器械滅菌器。用保鮮膜包裹MS 培養(yǎng)基罐蓋子與罐身的接口處，纏2～3 圈，隔絕其他真菌；將全部培養(yǎng)罐整齊地擺放在組培室架子上。

4 蘭科植物與真菌的關(guān)系

真菌與蘭花形成了一種共生的關(guān)系，真菌有助于蘭科植物對氮磷鉀等元素的吸收，也有文獻報道真菌能分泌激素，從而促進蘭花的生長。培養(yǎng)基是根據(jù)培養(yǎng)對象所需營養(yǎng)配置的一種固態(tài)的營養(yǎng)來源，能為蘭花提供生長所必需的營養(yǎng)，相當于真菌的作用。蘭花自己會主動找到適合的真菌，但用培養(yǎng)基培養(yǎng)蘭花省去了蘭花自己尋找真菌的不確定性，加快了萌發(fā)速度，讓蘭花長得更好。雖然無菌培養(yǎng)已成為如今挽救蘭科植物必不可少的一個途徑，但其中卻仍存在著無菌苗易退化，移栽成活率低、病害嚴重等問題。

5 結(jié)果分析

5.1 蘭科植物對生長環(huán)境要求苛刻

據(jù)資料顯示，光照時間、溫度、濕度、是否通風都會影響蘭花的生長。當光照不足時，蘭株軟弱徒長；光照過強時，葉子會被曬黃或曬焦，失去觀賞價值甚至死亡。蘭花的栽培溫度隨著產(chǎn)地和品種的不同各不相同。種植蘭花的濕度要維持在80%以上，冬季為半休眠期，這時濕度可降至50%亦可。種植蘭花的場地必須要保持良好的通風環(huán)境，在我們種植過程中，通過觀察發(fā)現(xiàn)蘭花苗在營養(yǎng)條件較好的情況下生長得十分旺盛，但這也會導致蘭花苗生長過于集中而營養(yǎng)不足而死。蘭花苗移植實驗就是針對此情況來改變蘭花苗的生長環(huán)境，使每株蘭花苗都能獲取到足夠的養(yǎng)分。

5.2 竹枝石斛的繁殖能力最強

從數(shù)據(jù)中可以看出，四種蘭花種子中，竹枝石斛種子的染色率，即種子的成活率最高，因此在冬鳳蘭、鼓槌石斛、金釵石斛和竹枝石斛這四種蘭花中，竹枝石斛的繁殖能力最強。在進行染色實驗的四種蘭科植物里，竹枝石斛的活力比較高。TTC 染色的成功與否及著色程度主要取決于溫度、pH、濃度、保存時間以及種子的采集日期。TTC 浸泡種子保存時的溫度一般在30～35℃，pH正常應在6.5～7.5 之間，實驗所用的TTC pH 為6；TTC 浸泡種子的時間因被染色體的不同而不同，而四種實驗對象的種子浸泡時間均為24h；為了方便計算從采集種子到做實驗之間相隔的時間，確保種子不會因為儲存時間過久而全部死亡，四種蘭花種子的采集日期在上文已有記錄，不過四種蘭花種子的采集時間距做實驗的時間均較近，可以確保種子正常的存活率。從整體分析，蘭花種子在TTC 中浸泡的時間不夠，所以四種蘭花種子的染色程度也不一樣。

6 研究結(jié)論與建議

竹枝石斛適合大量培養(yǎng)并回歸自然以保護蘭科植物，先在實驗室內(nèi)培養(yǎng)蘭花及蘭花種子萌發(fā)所需的真菌可以有效地促進蘭科植物的繁殖，建議科研人員利用含有真菌的培養(yǎng)液大量培養(yǎng)竹枝石斛并回歸自然。