蘋果花葉病研究進展

李春霞

(延安職業技術學院,陜西 延安 716000)

0 引言

我國蘋果栽培面積和產量均居世界第一。延安地處西北黃土高原中部，由于海拔高、日照時間長，晝夜溫差大，被世界公認的最佳蘋果優生區，生產的蘋果深受國內外市場的青睞。蘋果栽培分布在全市13個縣區，且面積和規模迅速擴大。根據立地條件，分為旱塬蘋果(南部5個縣)和山地蘋果(北部8個縣(區))兩大產區。2020年全市蘋果面積達到26.67萬hm2，產量達到400萬t，蘋果產業已經成為延安的主導產業和農民脫貧致富奔小康的主要途徑，同時對水土保持和生態綠化建設發揮重要作用。

蘋果花葉病( Apple Mosaic)在國內外蘋果種植區普遍存在[1～3]。近年來，隨著栽培面積的迅速擴大，育苗規模擴大，苗木的頻繁調運，花葉病日趨嚴重，成為蘋果生產中危害嚴重且難防治傳染病之一，給蘋果高產優質帶來很大影響，為此，筆者通過大量田間觀察調查和查閱資料，從蘋果花葉病危害、病原種類及鑒定方法、防治措施等方面進行了概述，為人們更加全面認識蘋果花葉病和后續研究提供參考。

1 蘋果花葉病的危害

蘋果花葉病病毒主要危害葉片，除侵染蘋果外，還侵染梨、花紅、桃、櫻桃、山楂、木瓜等薔薇科果樹植物[4],1963年Kristensen和Thomsen 通過調查和試驗發現蘋果花葉病毒科侵染19個屬的65種植物[5]。

1.1 對生長結果的影響

經田間觀察和查閱資料證實，一年生枝條感染病后，節間變短，樹體生長緩慢，延遲結果；多年生樹感病后，削弱樹勢，枝葉生長緩慢，不易成花，即使結果，在6月份也容易落果，果實小、畸形果多、味淡、不耐貯藏，降低產量和品質，嚴重者造成早期落葉[6～8]。

王永宗調查認為，蘋果花葉病主要發生在老齡果樹，嚴重老齡果園發病率在20%，平均減產在30%左右[9]。但經本人近10 a在延安13個縣田間調查觀察，隨著蘋果栽植面積的不斷擴大，除了20多年老齡果園花葉病越來越重外，新栽幼樹和未結果樹也很嚴重，甚至在一千多畝高標準新建示范園中，有的地塊病株率達到15%～25%，嚴重影響果樹早果豐產。

1.2 對葉綠素含量和光合作用的影響

花葉病造成品質和產量是由于影響葉綠素和花青素的含量。柴光臻等研究表明，蘋果花葉病能顯著降低蘋果葉片葉綠素含量和葉片凈光合速率[10]；田明璐研究結果表明，隨著病害嚴重程度的增大,蘋果葉片的花青素含量升高[11]。

1.3 對細胞形態結構的影響

Fulton等對蘋果花葉病毒粒體的研究發現，花葉病毒在體外非常不穩定，在54℃的熱穩定性只有10 min，在含0.02M2-巰基乙醇的緩沖液中只能保持2～3 h的侵染活性。電鏡觀察發現蘋果花葉病毒粒子的大小為25 nm或29 nm[12]。張明珍選用花葉病毒葉片進行超薄電鏡切片觀察，發現蘋果花葉病葉片的細胞發生明顯變化，病毒粒以分散的長線狀形式聚集排列在細胞質中，葉綠體畸形且數目減少，淀粉粒膨脹、增多，在葉綠體內發現有鐵蛋白存在，遠離細胞壁[13]。

2 蘋果花葉病癥狀表現

蘋果花葉病癥狀表現受病原株系、環境條件影響(尤其是溫度、光照等因素)變化較大。主要癥狀類型有斑駁型、花葉型、網斑型、云斑型、環斑型、鑲邊型及以上癥狀的混合型，枝條和果實則沒有明顯病癥[3,13]。

在田間同一株、同一枝或同一葉片常常出現不同癥狀 ，但以花葉型、斑駁型和云斑型幾種類型居多。成年樹上的癥狀發展較慢，并且表現在部分枝條上，常經過幾年后仍然局限于部枝紙條上；但在苗木上則發展很快，在發病當年即可全株出現癥狀。

3 果樹病毒的檢測方法

果樹病毒檢測方法隨著科學技術發展而不斷提高，由最初的生物鑒定，增加了血清鑒定、電子顯微技術鑒定、熒光鑒定及分子生物學鑒定等多種方法，各種方法各有優勢，取長補短，相互配合，使得檢測時間不斷縮短，準確性不斷提高。

3.1 生物學檢測(即指示植物法)

這是一種比較傳統的病毒檢測方法(也叫指示植物法)。即利用指示植物對病毒敏感性進行測試。當指示植物受不同病毒侵染時，能夠快速顯現出不同的生物學癥狀，根據特異性生物學癥狀表現判斷病毒的種類。這種方法簡單、方便、直觀、成本低，可在大田、溫室或試管嫁接方法，但因速度慢且靈敏度低。

3.2 血清學檢測

主要是指酶聯免疫吸附分析方法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA法)。該方法實驗成本低、簡單、特異性好、快速，能夠對大量樣品進行快速、靈敏、準確的檢測，是當前植物病毒檢測中應用最廣泛的方法。但是ELISA法的準確性往往依賴于抗血清的品質以及病毒濃度。不同實驗材料、組織部位、取樣時間，樣品中病毒濃度變化差異較大，會導致ELISA檢測結果出現假陰性[14]。溫度過高會降低樣品中的病毒含量，降低ELISA檢測結果的可信度。此外，病毒變異較快、株系復雜，容易導致特定病毒抗體不能識別特異抗原或識別程度下降，從而導致漏檢或錯檢[15]。杜國榮等研究表明，病毒濃度低的寄主植物中的病毒不易被檢測到[16]。

3.3 電子顯微檢測

電子顯微鏡檢測可以準確、直觀的看到病毒性態結構、在寄主細胞內存在狀態以及引起寄主細胞的病變和內含體特征，是深度研究引起病變細胞超微結構變化和細胞學方面的重要手段。但是電鏡儀器昂貴、操作復雜，技術水平要求高。這種方法不適于大量樣本檢測[17]。

3.4 分子生物學檢測

逆轉錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription PCR，簡稱RT-PCR)技術，具有檢測速度快、靈明度高、特異性強的優勢，已用于多種植物病毒的診斷與檢測[18～20]。在果樹病毒檢測方面應用的分子生物技術主要包括核酸分雜交技術、多聚酶鏈式反應技術、雙鏈RNA電泳技術、熒光定量PCR(real-time PCR)技術,又稱實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)技術等。有研究認為RT-qPCR技術檢測靈敏度是ELISA檢測的106倍[21]；尤其是一步法RT-qPCR的應用，具有更好的特異性[22]。這種方法可以適用于大樣本病毒檢測。

3.5 高通量測序技術

又稱為下一代測序(Next Generation Sequencing NGS),是能夠給予病毒入侵植物后產生的小干擾進行測序分析的技術方法，利用它能夠發現新的病毒分子及其致病機理[23]。

4 蘋果花葉病病毒種類檢測及確定

蘋果花葉病病原種類問題，隨著植物病毒研究方法和技術不斷提高，蘋果花葉病毒鑒定技術也在不斷改進和創新，對病毒種類得到進一步認識。從首次報道蘋果花葉以來，人們普遍認為，引起花葉病的病原為單一蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus，ApMV)侵染所致，并且也做了大量的研究檢測確認，如韓禮星(1991年)曾利用指示植物和血清學方法檢測到蘋果花葉病毒[24]，洪霓等(1994年)采用A蛋白酶聯免疫法檢測了蘋果花葉病毒，并對血清學檢測蘋果花葉病毒進行探討，隨后，專家學者們將先進的分在生物技術應用到蘋果花葉病的檢測中[25]。楊俊玲于2004年，首次建立了蘋果花葉病毒(ApMV)和李屬矮縮病毒(PDV)RT—PCR檢測體系,并優化了ApMV的RT—PCR監測體系，實現了高效低成本檢測類[26]，候義龍等[27]和冀志蕊等[28]也分別研究建立了蘋果花葉病毒RT-PCR檢測技術。

也有一些專家學者認為引起蘋果花葉病的毒原是李屬壞死環斑病毒(Prunus nicrotic ringspot apple mosaic strain virus，PNRSV)中的蘋果花葉株系[6,7]。另外，邱強曾報道除蘋果花葉病毒外，還有李屬壞死環斑病毒中的蘋果花葉株系，這種病毒在我國是否存在及分布情況，有待研究。2016年Hu et al.在中國首次報道了李屬壞死環斑病毒(PNRSV)能夠侵染蘋果葉片，引起花葉病[29]，梁鵬博等研究也說明，李屬壞死環斑病毒(PNRSV)可能會引起蘋果花葉病[30]。

近年來，高通量測序技術在蘋果花葉病病毒檢測和鑒定中得到運用，檢測出引起花葉病新的病原--蘋果壞死花葉病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)，它與ApMV和PNRSV親緣關系較近，可能是引起我國蘋果花葉病的病原[23,31～32]。國內外在蘋果花葉病病葉中檢測到蘋果壞死花葉病毒(ApNMV)的報道也有一些[33～36]。有專家在山東棗莊海棠花葉病葉片中也檢測出蘋果壞死花葉病毒[37]。這些研究結果證實李屬壞死環斑病毒和蘋果壞死花葉病毒都是引起蘋果花葉病的病原[38]。

綜上所述，引起蘋果花葉病的病原不是由單一花葉病毒引起，而是由不同病毒引起系統侵染病害。

5 蘋果花葉病發病規律

Vibert于1863年正式報到蘋果花葉病的發生，指出該病能夠通過芽接傳播，后來Blodgett(1923)[39]和Bradford(1933)[40]試驗也證明蘋果花葉病可借芽接和切接進行傳播，這是最早證明能夠通過嫁接傳播的病毒病害之一。人們普遍認為病毒主要靠嫁接傳播，無論砧木或接穗帶毒，均可形成新的病株。蘋果花葉病毒(ApMV)既不能夠通過帶毒的種子和花粉傳播，也沒有相關傳播媒介被報道[41～42]。

李屬壞死環斑病毒(PNRSV)的種子和花粉傳毒機理研究較為透徹。PNRSV入侵花粉粒，感染胚囊和生殖細胞，減少花粉粒萌發，延遲花粉管的生長[43～44]。PNRSV在種子發育的早期就能夠侵染包括胚在內的種子的所有部分。進行感染PNRSV杏果實的種子萌發試驗發現，10%的感病種子能夠完成PNRSV的侵染過程，部分幼苗表現嚴重的萎縮現象[45]。

嫁接后的潛育期長短不一，一般在3～27個月之間，氣溫10～20℃時，光照較強，土壤干旱及樹勢衰弱時，有利于癥狀表現。幼苗接種后，潛育期一般較短。

蘋果花葉病癥狀表現，在蘋果萌芽后10～20 d表現出來，在幼果期(花后20～30 d)發展迅速，其后急劇減緩。7～8月盛夏期，病害基本停止發展，甚至出現癥狀隱蔽現象。9月初病樹抽發秋稍后，癥狀又重新開始發展，10月份又急劇減緩，11月份完全停止。

6 蘋果花葉病防治方法

6.1 選用無病毒接穗和砧木

栽培無病毒苗木，是防治蘋果花葉病毒的根本措施[3,6～9，46～47]。但是由于無毒苗木繁殖程序復雜，技術水平要求高，環境條件要求嚴格，價格貴，在生產上應用很少，大面積推廣也較為困難。因此，在繁育苗木是，嚴格選用無病毒接穗和砧木是簡單實用的最有效的辦法[48～50]。

6.2 使用有效藥劑，是控制病害的發生發展最有效的方法

在生產中，要加強管理，增強樹勢，提高抗病能力；對于嚴重的病枝要剪除或嚴重的病苗要拔掉，這些對預防和減少花葉病的發生有重要作用。對已經掛果的果園，使用有效藥劑，是控制病害的發生發展最有效的方法。許多專家使用化學農藥也進行了大量研究，如春季發病初期，可試噴灑1.5%植病靈乳劑1 000倍液或83增抗劑100倍液，20%鹽酸.嗎林胍.銅可濕性粉劑(毒克星，原名病毒A)4 000倍液，隔10～15 d噴1次，連續2～3次,可有效防治花葉病。 用20%嗎胍.乙酸銅灌根，在3月20日～4月20日防治蘋果花葉病效果可達約98%以上[8,51～52]。趙小明等用寡聚半乳糖醛酸300倍～500倍噴霧，防效達87%,81%～92.08%[53]。呂開偉等采用放射溝根施施果多防治蘋果花葉病田間試驗，防治效果達75%，既能增產又能提早成熟期[54]。楊鴛研究表明，6%阿泰靈(寡糖.鏈蛋白)1 000倍液、10%病毒唑1 500倍液和2%嗎啉胍.銅1 000倍液對花葉病都有防治效果，并且用6%阿泰靈輸液滴干技術，不僅可以防治花葉病，還可以提高果實品質[55]。

7 展望

7.1 利用生物農藥及復配劑防控需要試驗

蘋果花葉病因為發病較慢，常不被人重視。隨著病害越來越重，盡管在防治上已取得了一定進展，但是生物農藥、生物農藥與生長調節劑(如蕓苔素)復配在防治蘋果花葉病方面報道還很少，隨著藥肥雙減在生產中的實施進展，迫切需要不斷研究新的生物農藥及復配劑防效試驗。

7.2 實生苗花葉病病原需要鑒定

專家學者研究認為，蘋果花葉病毒(ApMV)既不能夠通過帶毒的種子和花粉傳播，也沒有相關傳播媒介被報道[41～42]。但國內外都曾在實生苗圃里見到花葉病株，根據在一些地區調查(1977年)看到不少海棠實生苗中有花葉病株，可見種子傳染花葉病毒的可能性是很大的[6,8]。這是由李屬壞死環斑病毒侵染種子引起，還是由最新發現的蘋果壞死花葉病毒侵染種子引起，目前尚無確切的試驗證明， 有待于進一步研究。另外，關于新發現的蘋果壞死花葉病毒致病機理和傳播途徑，文獻報到較少。

7.3 新品種對花葉病抗性需要研究

錦繡海棠由于結果早、豐產，風味美，成熟早，是集觀賞和鮮食為一體的優良品種，深受人們的青睞，近年來，作為矮化密植新建果園優良的授粉樹或觀光園的主栽品種，面積在不斷擴大。經過在延安富士和錦繡海棠在同一塊地或同一個果園中調查觀察，紅富士蘋果樹或輕或重都有花葉病，而錦繡海棠卻沒有見到花葉病，是否錦繡海棠較抗蘋果花葉病，有待研究。