醬香型白酒二輪次堆積酒醅微生物群落與理化指標相關性研究

張春林，楊 亮，李 喆，甘廣東，何珺珺

（茅臺學院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564501）

堆積發酵是醬香型白酒生產的獨特工藝，高粱經過蒸煮后，加入高溫大曲，在生產場地堆積發酵，再進入窖池發酵，堆積時間根據季節、氣溫和工藝要求實時調整，最長可達到10 d以上。該工藝一方面是對酒曲中微生物擴增，并網羅場地和空氣中的微生物，為后續的窖內發酵工藝富集微生物，另一方面在多種微生物和酶類的共同作用下堆積酒醅產生了醬香型白酒的酒體風味物質和風味前體物質，因此該過程也被稱之為“二次制曲”，對醬香風味物質的生成及酒精發酵至關重要[1-2]。

醬香型白酒的堆積的核心是微生物的富集和增殖。隨著技術的進步，高通量測序技術已逐步成熟，并廣泛應用于發酵食品微生物群落的研究，包括醬油[3]、食醋[4]、黃酒[5]、濃香型[6]和清香型白酒[7]等。王鵬等[8]利用高通量測序技術確定了白酒發酵過程中的核心微生物，揭示了環境因子與核心微生物群的相互關系。黃蘊利等[9]利用高通量測序技術分析了傳統醬香型白酒堆積和窖池酒醅中的微生物群落結構，研究發現酒醅中的優勢細菌屬為芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬和乳桿菌屬。WANG H等[10]采用高通量測序方法對醬香型白酒堆積酒醅一至七輪次130個樣品進行測定，鑒定真菌7個門158個屬，細菌27個門658個屬，不同輪次之間微生物群落結構差異明顯。

在釀造過程中，溫度、酸度、水分、淀粉、還原糖等理化指標對釀造微生物群落的豐度及變化規律有重要影響，如溫度因素通過調控大曲發酵前期微生物群落的演替規律而影響成品曲中微生物群落的組成[11]；窖池的水分、酒精和淀粉含量對于微生物群落有著調控作用，同時會影響最終酒體風味[12]。二輪次作為取三輪次酒的前置輪次，酒醅內微生物群落結構及理化特性將對后續輪次的發酵有直接影響，解析二輪次堆積發酵酒醅內微生物群落及其與理化指標之間的相關性，將為調控下一個輪次發酵、提高醬香型白酒產量及品質起著重要作用。

本研究以醬香型白酒二輪次堆積發酵酒醅為研究對象，通過高通量測序技術解析堆積發酵過程中的酒醅微生物群落組成，結合多元統計分析揭示酒醅理化特性對微生物群落結構多樣性的影響。以期為醬香型白酒的釀造機理解析及發酵過程控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：樣品采集于茅臺某酒企1號車間的二輪次堆積發酵酒醅。堆積酒醅的采集時間為堆積發酵的第1～7天，即分別取堆積酒醅的上層樣品A為1號取樣點（堆積酒醅上層），中層樣品B由2、3取樣點混合后樣品（堆積酒醅中層），下層樣品C由4、5取樣點混合后樣品（堆積酒醅下層），再將A、B、C三個樣品混合形成一個樣品，置于-70 ℃條件下保存，分別記為D1、D2…D7[13]。

Ezup柱式細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；氫氧化鈉、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、葡萄糖、斐林試劑、次甲基藍指示劑、無水乙醇、濃鹽酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 2100生物分析儀：美國安捷倫公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋：常州潤華電器有限公司；DH-20008高速臺式冷凍離心機：上海德洋意邦儀器有限公司；ME204TE分析天平：梅特勒-托利多集團；D-78224超聲波清洗儀：德國Elma公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅微生物多樣性檢測

酒醅樣本基因組提取采用試劑盒，取質量合格的基因組樣品及對應的融合引物配制反應體系，開展聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，使用試劑盒磁珠對擴增產物進行純化并溶于洗脫緩沖液，完成建庫。使用Agilent 2100 生物分析儀對片段范圍及濃度進行檢測。檢測合格的文庫根據插入片段大小，選擇高通量測序平臺進行測序分析。提取酒醅微生物總基因組后，分別對基因組16S V4區和ITS1區擴增子測序分析[16-17]。

1.3.2 酒醅理化指標的檢測

每隔12 h（0 h、12 h、24 h、36 h…168 h）采集堆積酒醅上、中、下混合樣品測定酒醅理化指標。水分、酸度、淀粉、還原糖測定：參考DB34/T 2264—2014《固態發酵酒醅分析方法》[14]；酒醅溫度、粗蛋白測定：參照《白酒生產技術全書》[15]。

1.3.3 數據處理

采用SPSS19.0軟件進行理化指標數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 酒醅發酵過程中真菌微生物群落結構多樣性分析

2.1.1 真菌群落測序數據統計

如表1所示，按照相似性將得到的樣品所對應的分類序列條數歸類為可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。其中，OTU數量最多的是堆積發酵3 d的酒醅，共78個。所有樣品共有的真菌OTU數量為21。堆積發酵過程中酒醅樣品的物種豐富度的指標（Chao 1指數）在42～82之間；物種多樣性指標（Shannon指數）在1.43～1.91之間，堆積發酵5 d的Shannon指數達到最高值1.91。所有樣本的覆蓋率（Coverage）在0.999 7～0.999 9之間，測序結果能完整反映二輪次堆積發酵真菌菌群組成信息。

表1 酒醅真菌菌落測序數據統計分析Table 1 Statistical analysis of fungal community sequencing data of fermented grains

2.1.2 發酵過程中真菌群落的演替規律

如圖1所示，在醬香型白酒二輪次堆積發酵酒醅中共檢出4個門，包括子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）和壺菌門（Chytridiomycota），其中子囊菌門相對豐度達94%以上，占絕對優勢。而擔子菌門在醬香型白酒二輪次堆積發酵酒醅中相對豐度為0.16%～5.55%。接合菌門含量較低，相對豐度約為0.03%～0.65%。壺菌門只在個別樣品中檢出。

圖1 門水平真菌群落結構組成分布Fig.1 Distribution of fungal community structure at phylum level

二輪次堆積酒醅中共檢測出46個屬的真菌微生物，真菌微生物屬水平的群落組成如圖2所示，豐度＞1%的有8個屬，包括曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Candida）、裸胞殼屬（Emericella）、畢赤酵母屬（Pichia）、紅曲霉屬（Monascus）、毛孢子菌屬（Trichosporon）、節擔菌屬（Wallemia）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）。其中曲霉屬和紅曲霉屬占絕對優勢，曲霉屬相對豐度為2.70%～50.02%，發酵前期繁殖迅速，成為優勢菌，在第2天相對豐度最高。隨著溫度升高，曲霉屬相對豐度呈下降趨勢，發酵后期豐度逐漸降低。紅曲霉屬相對豐度為15.08%～52.47%，在第5天相對豐度達到峰值。假絲酵母屬相對豐度為0.01%～67.25%，在堆積發酵過程中其相對豐度持續增加，假絲酵母屬是醬香型白酒中的主要功能微生物，是醬香型白酒堆積發酵酒醅中的優勢真菌，在酒醅和大曲中均有檢出[18]。畢赤酵母屬相對豐度為0.26%～2.09%，在堆積發酵中期波動增加，畢赤酵母屬屬于耐高溫酵母菌，是酒醅發酵過程中產乙醇和產酯的功能菌，雖有報道稱堆積發酵過程中酒醅中的畢赤酵母屬來自發酵環境[19]，但大曲中也存在畢赤酵母屬[20]，其具體來源還需進一步探索。

圖2 屬水平真菌群落結構組成分布Fig.2 Distribution of fungal community structure at genus level

2.2 酒醅發酵過程中細菌微生物群落結構多樣性分析

2.2.1 細菌群落測序數據統計

酒醅細菌菌群測序數據統計分析見表2。由表2可知，其中堆積發酵6 d的酒醅中細菌的OTU數最多為243，所有樣品共有的細菌OTU數為65。堆積發酵過程中酒醅樣本的Chao 1指數在115～206之間；Shannon指數在2.40～2.80之間，堆積發酵第3天的Shannon指數最高，說明二輪次堆積3 d可使酒醅內微生物多樣性達到最高。所有樣本的覆蓋率在0.999 2～0.999 7之間，測序結果能完整反映二輪次堆積發酵細菌菌群組成信息。

表2 酒醅細菌菌落測序數據統計分析Table 2 Statistical analysis of bacteria community sequencing data of fermented grains

2.2.2 發酵過程中細菌群落的演替規律

如圖3所示，二輪次醬香型白酒堆積酒醅中共檢出11個細菌門，包括放線菌門（Actinobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、泉古菌門（Crenarchaeota）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）。其中，厚壁菌門、變形菌門、放線菌門占絕對優勢。

圖3 門水平細菌群落結構組成分布Fig.3 Distribution of bacterial community structure at phylum level

二輪次醬香型白酒堆積酒醅中共檢測出125個細菌屬微生物。如圖4所示，其中相對豐度＞1%的有7個屬，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、光岡菌屬（Mitsuokella）。其中，有3個屬豐度較高，是二輪次的主導菌屬，分別是芽孢桿菌屬、海洋芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬。其中高溫放線菌屬占絕對優勢，相對豐度為12.48%～30.64%，且隨著堆積發酵時間的延長，豐度逐漸增加。海洋芽孢桿菌屬相對豐度為10.04%～30.88%，豐度呈現先上升后下降最后穩定的趨勢，相對豐度從最初的13.24%增加至30.88%，從第3天開始逐漸下降，后期相對豐度保持在10%左右。芽孢桿菌屬相對豐度為5.90%左右。

圖4 屬水平細菌群落結構組成分布Fig.4 Distribution of bacterial community structure at genus level

芽孢桿菌屬是醬香白酒中醬香風味物質的主要代謝菌屬，能分泌蛋白酶、淀粉酶等水解酶類，分解原料形成豐富的發酵前體物質，有利于風味物質的形成[21]。如熱乳桿菌具有分解蛋白質和水解淀粉的能力，可產酸、增香、增加酒體的綿甜感。地衣芽孢桿菌能生成如吡嗪類、芳香類、酸類及酚類化合物等風味物質[22]，賦予了醬香型白酒獨特的風格及健康因子。海洋芽孢桿菌屬屬于芽孢桿菌科，該屬主要分布于深海環境、發酵食品環境[23]，某些物種可用于氧化酶、淀粉酶、過氧化氫酶、酯酶和脲酶等工業酶制劑生產[24]。該菌屬是醬香型白酒高溫大曲制曲過程中第二次翻曲階段的功能微生物，但具體的釀造功能未見報道[25]。

2.3 堆積發酵過程中理化指標分析

在醬香型白酒酒醅堆積過程中，水分、溫度、總酸、蛋白質、淀粉含量、還原糖等理化指標隨著堆積時間發生變化，并影響微生物的代謝和風味物質的形成。

水分是醬香型白酒生產過程中重點控制的工藝參數[26]。水分過高，堆積酒醅透氣性差，好氧性微生物生長受到抑制，厭氧菌含量增加，導致酒醅酸敗[27]。水分過低，微生物的代謝受抑制，影響酒的產量和質量。如圖5所示，二輪次酒醅在堆積過程中水分含量在47%～50%之間，在0～84 h其呈下降趨勢，在84～168 h呈上升趨勢，前期隨著發酵溫度的升高，水分蒸發速度增加，水分含量下降，后期伴隨著微生物的大量繁殖和淀粉降解，水分含量呈現逐漸上升趨勢。

圖5 二輪次堆積發酵過程中酒醅理化指標變化情況Fig.5 Changes of physical and chemical indexes of fermented grains during the second rounds stacking fermentation

蛋白質是釀造過程中微生物的主要氮物質來源，具有形成風味物質、促進美拉德反應以及酒體風味特征形成等功能[28]。在二輪次堆積發酵過程中，酒醅中的粗蛋白呈上升的趨勢，含量從6.16%增加至6.99%。

淀粉是釀造過程中微生物生長繁殖的能量來源，淀粉含量高低與出酒率成正比。由圖5可知，在二輪次堆積發酵過程中，隨著發酵時間的延長，酒醅中淀粉含量逐漸下降，從27.88%下降至24.73%，淀粉逐漸被微生物分解。

由淀粉等多糖物質水解可形成還原糖。酒醅中還原糖含量的變化情況基本上反映了糖化與發酵速度的平衡與協調。如圖5所示，還原糖含量在二輪次堆積過程中呈明顯的上升趨勢，含量從0.65%上升至1.00%。

在堆積發酵過程中，酸物質含量呈現動態變化趨勢。如圖5所示，在堆積發酵前期細菌大量生長繁殖并分泌有機酸，酒醅酸度緩慢上升。酒醅堆積48 h后，由于堆積溫度的上升，產酸微生物代謝活動被抑制，且有機酸在酯類等風味物質的合成過程中被消耗，在堆積后期酒醅中酸度呈下降趨勢。

溫度是評價高溫堆積成效的重要指標之一[29]，當堆積酒醅頂溫達到50 ℃左右進入窖池發酵，適宜的溫度有助于酒體風味的形成和質量的提高。如圖5所示，在二輪次堆積發酵過程中，伴隨著微生物的大量生長代謝所釋放的熱量使堆溫持續升高，頂溫達到50 ℃以上。

2.4 理化指標與微生物群落相關性分析

為了探究堆積發酵過程中微生物之間相互作用關系，以及酒醅理化指標對酒醅微生物多樣性的影響，利用SPSS軟件對酒醅優勢微生物屬（相對豐度＞1%）和酒醅樣品的理化指標（水分、粗蛋白、淀粉、總酸、溫度和還原糖）進行斯皮爾曼（Spearman）相關性分析并計算相關系數，結果見表3。

表3 堆積發酵酒醅中理化指標與優勢微生物屬的相關性Table 3 Correlation between physicochemical parameters and dominant microbial genera in fermented grains during stacking fermentation

結果表明，粗蛋白含量與裸胞殼屬、畢赤酵母屬的豐度呈負相關，與假絲酵母屬的豐度呈正相關，其中粗蛋白含量與裸胞殼屬的相對豐度呈極顯著負相關（P＜0.01）。淀粉、總酸含量與海洋芽孢桿菌屬、曲霉屬、裸胞殼屬、畢赤酵母屬、節擔菌屬的相對豐度呈正相關，其中淀粉含量與曲霉屬、裸胞殼屬的相對豐度呈極顯著正相關（P＜0.01），總酸含量與海洋芽孢桿菌屬、曲霉屬、裸胞殼屬、畢赤酵母屬的相對豐度呈極顯著正相關（P＜0.01）。溫度與假絲酵母屬的相對豐度呈正相關，與裸胞殼屬、畢赤酵母屬的相對豐度呈負相關，其中溫度與裸胞殼屬的相對豐度呈極顯著負相關（P＜0.01）。還原糖含量與海洋芽孢桿菌屬、假絲酵母屬的相對豐度呈正相關，與裸胞殼屬、畢赤酵母屬的相對豐度呈負相關，其中還原糖含量與裸胞殼屬的相對豐度呈極顯著負相關（P＜0.01）。在堆積過程，水分、粗蛋白、淀粉、總酸、溫度、還原糖等指標都在發生變化，影響著微生物的繁殖和代謝，同時這些條件也受到微生物繁殖和代謝的影響。通過研究分析，將微生物群落與理化指標變化規律相關聯，對闡明堆積工藝的釀造機理，提高醬香型白酒品質和發酵效率具有重要意義。

3 結論

本研究利用高通量測序法分析醬香型白酒二輪次堆積發酵酒醅樣品中的微生物組成，并采用多元統計分析探討了理化因子對微生物結構的影響。共檢測出171個屬微生物，其中包括125個屬細菌，46個屬真菌。發酵過程中真菌以曲霉屬，假絲酵母屬，裸胞殼屬，畢赤酵母屬，紅曲霉屬，毛孢子菌屬，節擔菌屬，威克漢姆酵母屬等為主；細菌以芽孢桿菌屬，乳桿菌屬，海洋芽孢桿菌屬，高溫放線菌屬，枝芽孢菌屬、片球菌屬，光岡菌屬等為主。相關性分析結果表明，粗蛋白含量與裸胞殼屬的相對豐度呈極顯著負相關（P＜0.01），淀粉含量與曲霉屬、裸胞殼屬的相對豐度呈極顯著正相關（P＜0.01），總酸含量與海洋芽孢桿菌屬、曲霉屬、裸胞殼屬、畢赤酵母屬的相對豐度呈極顯著正相關（P＜0.01），溫度與裸胞殼屬的相對豐度呈極顯著負相關，還原糖含量與裸胞殼屬的相對豐度呈極顯著負相關（P＜0.01），水分含量與微生物多樣性之間相關性不顯著。本研究初步推斷了環境因子對群落驅動作用，后續將從功能層面，采用多組學技術，揭示堆積發酵過程中微生物的功能貢獻，為關鍵功能菌的挖掘及堆積發酵的調控提供理論依據。