山西老陳醋醋醅中醋酸菌的分離、ERIC分型及發酵特性研究

王超敏，李雅茹，魏莎莎，郎繁繁，周景麗，陳旭峰，許 女，*

（1.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.食醋發酵科學與工程山西省重點實驗室，山西 太原 030400；3.山西紫林醋業股份有限公司，山西 太原 030400）

傳統的山西老陳醋由獨特的混菌固態發酵工藝生產，獨特的釀造微環境形成獨特穩定的微生物發酵菌群，并賦予山西老陳醋獨特的口感與風味。山西老陳醋主體酸（醋酸）是由醋酸菌（acetic acid bacteria）產生的[1]。其中，巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）是醋酸發酵階段的主要優勢產酸菌，還具有產乙偶姻、川芎嗪等風味物質和功能活性物質的能力[2-4]。具備高溫、酒精、酸等耐受特性及高產酸、產乙偶姻一直是食醋產業選育醋酸菌菌種的目標方向。查婧等[5]從福建傳統紅曲醋中分離出一株產酸能力強的醋酸菌株，并鑒定為斯氏葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter swingsii）；梁叢穎等[6]采用傳統分離培養與16S rRNA基因序列分析相結合的方法從諾麗自然發酵汁中分離鑒定出24株醋酸菌，并篩選出一株發酵性能和耐受特性均良好的熱帶醋酸桿菌（Acetobacter tropicalis）；劉陽等[7]從保寧醋醋曲中篩選獲得醋酸桿菌（Acetobacter sicerae）A11，其產酸量為30.90 g/L；張燁等[8]從清徐醋廠的醋醅中分離得到5株產酸能力強的醋酸菌，其中醋酸菌F20可耐受體積分數13%的乙醇，醋酸菌F6可耐受高溫，在35 ℃高溫條件下產酸量達4.964 g/100 mL；吳越等[9]從杏皮渣醋中分離篩選出6株醋酸菌，醋化醋桿菌Ac02的醋酸產量最高（3.04 g/100 mL）。

目前，隨著現代菌株分子分型手段的發展，腸桿菌基因間保守重復序列（Enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）、隨機擴增多態性脫氧核糖核酸（random amplified polymorphic deoxyribonucleic acid，RAPD）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）等已被成功用于牛乳[10]、泡菜[11]、肉品[12]、黃酒[13]中大腸桿菌、芽孢菌、沙門氏菌、酵母菌菌株、醋酸菌菌株[14-15]的分型，使人們對于微生物種群結構特征、微生物多樣性、發酵規律等有了更加深入的了解。ERIC-聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術為利用ERIC序列中高度保守區來設計一對反向引物，進行PCR擴增，可根據所得到的擴增產物電泳條帶來區分細菌的株（型），相比于其他分型手段，其具有成本較低、操作技術簡單等特點。金莉莉等[16]用ERIC-PCR技術鑒定李斯特氏菌，與國標生化方法檢測結果完全一致，該技術可用于李斯特氏菌種、菌株的鑒定以及進一步分型研究；蘇戰強等[17]對27株新疆牛源大腸桿菌O157：H7分離鑒定及ERIC-PCR基因分型，27株分離菌有8種類型：A型有2株，B型是優勢菌、有10株，C型有3株，D型有8株，剩余菌株為分散型分布，有4種型；蘇俊霞[2]從鎮江香醋醋醅中分離出75株醋酸菌，分為三個型別：Ⅰ型有63個菌株，Ⅱ型有7個菌株，Ⅲ型有7個菌株。

目前，鮮有關于山西老陳醋來源醋酸菌菌株分型及型別與發酵特性關系研究。因此，本研究采用傳統培養分離方法從山西老陳醋醋醅中分離篩選醋酸菌，通過形態學觀察，結合分子生物學鑒定其種屬，同時進行ERIC-PCR分型，并研究其生長耐受性和產酸、產乙偶姻特性，旨在揭示山西老陳醋醋發酵菌群的特征、分型與性狀關系，從中篩選出優良菌株，以期將來開發成直投式發酵劑強化應用于山西老陳醋釀造中，達到提質增效的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醋醅：采集山西紫林醋業股份有限公司老陳醋醋酸發酵過程中的醋醅，發酵15 d，每隔1 d進行多點采樣，樣品裝入自封袋，取回后立即進行微生物分離。

1.1.2 試劑

細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京博邁德基因科技有限公司；PCR引物：由深圳華大基因公司合成；DNA Maker、MIX：生物工程（上海）有限責任公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

醋酸菌液體培養基[18]：1%酵母浸膏，2%葡萄糖，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min后加入1%無菌碳酸鈣和4%無水乙醇。固體培養基中加入2%瓊脂。

1.2 儀器與設備

T100型PCR儀、Universial Hood Ⅱ型凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；PHS-3C型pH計：上海佑科儀器儀表有限公司；YXQ-LS-50S11型多功能搖床：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；722型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

從泉州志愿服務開展的情況看，大部分志愿活動是由政府部分機構組織的，志愿者也是由政府機關工作人員組成。政府主導和行政推動的方式雖然有利于啟動志愿服務活動，但過分依靠行政推動往往會出現“被志愿”或志愿服務形式化或運動化的問題。[7]由于長期的行政化主導，一方面讓民眾產生誤解，以為志愿服務是政府行為；一方面很容易形成運動式，出現形式化的問題；一方面“被志愿”者在心理上對志愿服務活動會產生抵觸情緒。

1.3 試驗方法

1.3.1 山西老陳醋醋醅中醋酸菌的分離純化

采用無菌生理鹽水稀釋醋醅樣品，選取合適稀釋度的稀釋菌液涂布于醋酸菌固體培養基平板上，30 ℃條件下培養48 h后，挑取單菌落再次劃線于醋酸菌固體培養基進行分離純化，30 ℃條件下培養48 h后，觀察菌落形態，挑取具有透明圈的單菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察細胞形態特征。

1.3.2 山西老陳醋醋醅中醋酸菌的分子生物學鑒定

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以其為模板，利用引物27F（5'-AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACGGYTACCTI'GTI'ACGACTY-3'）[19]進行PCR擴增。PCR擴增體系：引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，模板2 μL，2×Mix 20 μL，雙蒸水（ddH2O）14 μL；PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 45 s，30個循環；72 ℃再延伸10 min。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA5.0生物學軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹，確定菌株種屬關系。

1.3.3 醋酸菌菌株的基因分型

以分離的醋酸菌菌株基因組DNA為模板，采用隨機引物ERIC1（5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'）和ERIC2（5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系（30 μL）：引物3 μL，模板3.5 μL，2×Mix 15 μL，雙蒸水（ddH2O）8.5 μL；PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像系統上觀察分析，進行ERIC分型。

1.3.4 醋酸菌菌株的發酵特性研究

（1）耐受性能測定

（2）產酸、產乙偶姻性能測定

將分離純化的醋酸菌分別接種于醋酸菌液體培養基，30 ℃、150 r/min條件下培養24 h，以2%（V/V）接種量接入100 mL醋酸菌液體培養基，30 ℃、150 r/min條件下培養24 h，按照文獻[21-22]中的方法對菌株產酸和產乙偶姻的能力進行測定。

2 結果與分析

2.1 醋酸菌的分離及鑒定

從山西老陳醋醋醅中共分離純化得到20株醋酸菌，分別編號為菌株SAV-CP-6、SAV-CP-25、SAV-CP-28、SAV-CP-37、SAV-CP-38、SAV-CP-40、SAV-CP-41、SAV-CP-73、SAVCP-74、SAV-CP-77、SAV-CP-80、SAV-CP-156、SAV-CP-160、SAV-CP-170、SAV-CP175、SAV-CP-1839、SAV-CP-1842、SAVCP-1843、SAV-CP-1870、SAV-CP-1884。選取典型菌株SAVCP-77，觀察其形態，其菌落形態和細胞形態（1 000×）見圖1。由圖1可知，菌落直徑為2 mm，呈規則圓形，乳白色，半透明，光滑，有光澤，細胞形態為桿狀，革蘭氏染色呈陰性（G-）。

圖1 山西老陳醋醅中典型醋酸菌SAV-CP-77的菌落（A）和細胞（B）形態Fig.1 Colony (A) and cell (B) morphology of typical acetic acid bacterium SAV-CP-77 from Shanxi aged vinegar Cupei

2.2 醋酸菌的分子生物學鑒定

20株醋酸菌菌株系統發育樹見圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列20株醋酸菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 20 strains of acetic acid bacteria based on 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株SAV-CP-175、SAV-CP-40、SAV-CP-41、SAV-CP-37、SAV-CP-1870、SAV-CP-170、SAV-CP-25、SAVCP-80、SAV-CP-160、SAV-CP-1839、SAV-CP-1884、SAV-CP-1842、SAV-CP-1843、SAV-CP-77、SAV-CP-6、SAV-CP-74、SAV-CP-73、SAV-CP-156與模式菌株巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）（FJ227313.1）、（Acetobacter pasteurianus）（KT724709.1）、（Acetobacter pasteurianus）（KY287771.1）聚于一支，親緣關系最近，最高可達到96%，因此，將這些菌株鑒定為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），菌株SAVCP-28、SAV-CP-38與模式菌株醋化醋桿菌（Acetobacter pomorum）（KF030772.1）、（Acetobacter pomorum）（NR114684.1）聚于一支，親緣關系最近，最高可達到99%，因此，將這些菌株鑒定為醋化醋桿菌（Acetobacter pomorum）。

蘇俊霞[2]采用16S rDNA測序從鎮江香醋醋醅中分離鑒定出22株巴氏醋桿菌、5株醋化醋桿菌、5株中間葡萄醋桿菌、3株木醋桿菌（Acetobacter xylinum）；胡會萍等[3]采用傳統菌種分離方法從山西老陳醋醋醅中分離出巴氏醋桿菌Ab7、醋化醋桿菌Af10、液化醋桿菌（Acetobacter liquefa-ciens）Af5、漢氏醋桿菌（Acetobacter hansenii）Au13和惡臭醋桿菌（Acetobacter rancens）Af20；郭旭凱等[4]也從山西老陳醋中分離出巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）、醋化醋桿菌（Acetobacter aceti），液化醋桿菌（Acetobacter liquefaciens）和惡臭醋酸桿菌（Acetobacter rancens）。綜上所述，不同地域、不同類型的醋種由于原料、工藝不同，主要的優勢醋酸菌菌屬也不同，而同一醋種類型，由于不同廠家釀醋工藝及地理環境的差異性，醋酸菌菌群結構也體現出差異性。

2.3 山西老陳醋醋醅中醋酸菌菌株的基因分型

為了解山西老陳醋醋醅中醋酸菌種內菌株的基因多樣性，采用ERIC技術對20株醋酸菌菌株進行基因分型，結果見圖3。由圖3A可知，18株巴氏醋桿菌主要呈現I、II、III、IV、Ⅴ共5個型別。其中菌株SAV-CP-25、SAV-CP-73、SAVCP-74、SAV-CP-1842、SAV-CP-77、SAV-CP-80、SAV-CP-156、SAV-CP-170、SAV-CP-1884歸為I型，菌株SAV-CP-37、SAVCP-40、SAV-CP-41、SAV-CP-6、SAV-CP-175歸為II型，菌株SAV-CP-1839、SAV-CP-160屬于III型，菌株SAV-CP-1870屬于IV型，菌株1843屬于Ⅴ型。由圖3B可知，2株醋化醋桿菌分為兩個不同的型別，其中菌株SAV-CP-28歸為I型，菌株SAV-CP-38歸為II型。HIDALGO C等[23]對傳統發酵柿子醋中分離出的糖化葡萄糖酸桿菌（Gluconacetobacter saccharivorans）、巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）、醋酸合胞菌（Acetobacter syzygii）、中間葡萄醋桿菌（Gluconacetobacter intermedius）和歐洲葡萄酸桿菌（Gluconacetobacter europaeus）進行鑒定，并進一步進行ERIC-PCR分型，結果共檢測到28種不同的醋酸菌基因型；GONZáLEZ á 等[24]采用ERIC-PCR對紅酒發酵中醋酸菌進行分型，結果表明，20株醋酸菌具有33種不同的ERIC分型。綜上所述，來源于老陳醋醋酸發酵過程中的20株醋酸菌具有菌株基因多樣性，可為菌株特性分析提供遺傳學基礎。

圖3 山西老陳醋醋醅中醋酸菌的ERIC基因分型結果Fig.3 Results of ERIC genotyping of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

2.4 山西老陳醋醋醅中醋酸菌的耐受性研究

2.4.1 溫度耐受性

山西老陳醋獨特的低溫酒化和高溫醋化釀造工藝，賦予了老陳醋風味醇厚、純正的特點。其中高溫醋化則需要醋酸菌菌種具有優良的高溫耐受性。20株醋酸菌的溫度耐受性見圖4。由圖4可知，隨著溫度的升高，各菌株的生物量基本呈下降趨勢。溫度為30～45 ℃時，各醋酸菌生長較好，溫度升至50 ℃時，各醋酸菌的生長受到一定抑制。

圖4 山西老陳醋醋醅中20株醋酸菌菌株的溫度耐受性Fig.4 Temperature tolerance of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

整體來講，巴氏醋桿菌的Ⅱ型菌株的溫度耐受性優于Ⅰ型，醋化醋桿菌的Ⅱ型菌株的溫度耐受性優于Ⅰ型。其中耐受性能優良的菌株依次為：Ⅲ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1839，Ⅱ型巴氏醋桿菌SAV-CP-41、SAV-CP-170，Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-74，當溫度達到50 ℃時，巴氏醋桿菌SAVCP-1839的OD600nm值為0.248。

2.4.2 酒精耐受性

在食醋釀造的酒精發酵末期，其酒精度可以達到9% vol左右，因此篩選高酒精耐受性醋酸菌菌株對于快速啟動醋酸發酵具有重要意義。20株醋酸菌的酒精耐受性見圖5。由圖5可知，隨著酒精度的升高，各菌株的生物量基本呈下降趨勢。酒精度為6% vol～8% vol的條件下，各菌株生長較好，酒精度升至10% vol時，各菌株的生長開始受到一定抑制，酒精度升至12% vol，各菌株的生長受到明顯抑制。Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1884，Ⅱ型巴氏醋桿菌SAV-CP-175、SAV-CP-41和Ⅰ型醋化醋桿菌SAV-CP-28在各酒精度條件下生長較好，表現出較好的耐受性；其中Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1884在酒精度為10% vol時生長最為旺盛，可耐受10% vol的酒精度。張志燕等[25]從鎮江香醋醋醅中得到醋酸菌D-3-4可耐受體積分數為9%的乙醇。

圖5 山西老陳醋醋醅中20株醋酸菌菌株的酒精耐受性Fig.5 Alcohol tolerance of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

2.4.3 酸度耐受性

20株醋酸菌菌株的酸耐受性見圖6。由圖6可知，整體來講，醋化醋桿菌的耐酸性低于巴氏醋桿菌。在pH為5的條件下，各菌株生長較好，當pH降至3時，各菌株的生長受到一定影響。Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-77、SAV-CP-156、SAV-CP-74、SAV-CP-1884，Ⅱ型巴氏醋桿菌SAV-CP-37、SAV-CP-40、SAV-CP-175，Ⅲ型巴氏醋桿菌SAV-CP-160在各酸度條件下生長較好，表現出較好的耐受性。Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1884的酸耐受性最強，在pH為3時，OD600nm值為0.223。

圖6 山西老陳醋醋醅中20株醋酸菌菌株的酸度耐受性Fig.6 Acidity tolerance of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

2.5 不同分型醋酸菌產酸、產乙偶姻的特性研究

2.5.1 產乙酸能力

乙酸是山西老陳醋酸味的主要成分，其含量與產生速率對山西老陳醋的品質及發酵工藝都有著深遠的影響[26]。因此，篩選高產酸的醋酸菌菌株對于山西老陳醋的提質增效具有重要理論依據。20株醋酸菌菌株的乙酸產量見圖7。

圖7 山西老陳醋醋醅中20株醋酸菌菌株產乙酸能力的測定結果Fig.7 Determination results of acetic acid production ability of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

由圖7可知，20株醋酸菌的乙酸產量在0.30～9.87 g/L之間，整體來講，醋化醋桿菌產乙酸能力要低于巴氏醋桿菌。Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-156、SAV-CP-1884、SAV-CP-73、SAV-CP-74、SAV-CP-80，Ⅱ型巴氏醋桿菌SAV-CP-41、SAVCP-6和Ⅴ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1843的乙酸產量均在6.0 g/L以上，其中Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1884的乙酸產量最高，為9.87 g/L。

2.5.2 產乙偶姻能力

20株醋酸菌菌株的產乙偶姻能力見圖8。

圖8 山西老陳醋醋醅中20株醋酸菌菌株產乙偶姻能力測定結果Fig.8 Determination results of acetoin production ability of 20 strains of acetic acid bacteria from Shanxi aged vinegar Cupei

由圖8可知，20株醋酸菌產乙偶姻能力差異較大，醋化醋桿菌產乙偶姻性能弱于巴氏醋桿菌。Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-73、SAV-CP-80、SAV-CP-156、SAV-CP-170、SAVCP-1884，Ⅱ型巴氏醋桿菌SAV-CP-175和Ⅲ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1839菌株產乙偶姻性能較強，達到0.52 mg/mL以上。其中Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-73的乙偶姻產量最多，為0.97 mg/mL，Ⅰ型巴氏醋桿菌SAV-CP-1884的乙偶姻產量次之，為0.86mg/mL。乙偶姻是山西老陳醋重要功能活性物質—川芎嗪的重要前體[27]。劉娜[27]對鎮江香醋醋酸發酵過程川芎嗪前體的生物合成途徑進行研究，發現乙偶姻、雙乙酰及銨根離子是川芎嗪合成的重要前體物質。陳繼承等[28]對食醋中乙偶姻和川芎嗪含量進行測定發現食醋中乙偶姻和川芎嗪含量具有顯著的相關性。

3 結論

通過傳統培養分離方法從山西老陳醋醋醅中共分離出20株醋酸菌，經形態觀察及分子生物學鑒定，鑒定18株醋酸菌為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），2株醋酸菌菌為醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）。采用ERIC技術對其基因進行分型，結果表明，醋酸菌種內具有基因多樣性，18株巴氏醋桿菌共有5個分型（I～V型），2株醋化醋桿菌共有2個分型（Ⅰ和Ⅱ型）。通過發酵特性研究發現，巴氏醋桿菌及醋化醋桿菌的Ⅱ型菌株的溫度耐受性均優于Ⅰ型；巴氏醋桿菌Ⅰ型菌株產酸、產乙偶姻能力優于其他型的菌株。在此基礎上，篩選出1株性能良好的菌株為巴氏醋桿菌SAV-CP 1884，其可耐受高溫45 ℃、酒精度10% vol以及pH 3的酸性環境，乙酸產量高達9.87 g/L、乙偶姻產量為0.86 mg/mL。