基于高通量測序技術分析濃香型白酒大曲真菌菌群多樣性

周 森，王 成，朱紹賓，趙文俊，劉京國

（北京農學院 生物與資源環境學院 農業農村部華北都市農業重點實驗室，北京 102206）

白酒是我國特有的傳統發酵食品，具有悠久的釀造歷史和文化內涵，根據不同香型分類，我國白酒可被細分為清香型、濃香型、米香型、醬香型等12種香型。其中，濃香型白酒以“窖香濃郁、綿柔甘洌、香味協調”的酒體風格在我國白酒行業中占據主導地位，其年產量占全國白酒的70%左右，在國家級名酒中約占50%[1]。濃香型白酒風味的形成除與原料、釀造工藝有關，還與大曲的質量有著重要聯系，大曲是濃香型白酒生產的前提，是釀造優質濃香型白酒的關鍵[2]。濃香型大曲常以小麥為原料，采用生料制曲，自然接種，自然發酵而成，品溫可達50～60 ℃[3]。由于大曲制作過程中受原料、環境的影響較大，使得大曲中微生物情況十分復雜。已有研究表明，濃香型大曲中含有大量不同種類的真菌和細菌，其代謝所產生的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等對白酒發酵、生香及產酯等方面起著重要作用[4]。

目前，對于濃香型大曲真菌微生物研究主要有傳統分離方法和免培養方法兩種。如向慧平等[5]利用純培養技術對11份濃香型白酒大曲酵母進行選擇性分離，所獲得的194株酵母菌均歸屬于酵母目；竇驍等[6]對濃香型白酒大曲酵母菌進行分離鑒定，共獲得260株酵母菌，分為22個種，并確定異常維克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）是制曲過程中的優勢酵母，扣囊覆膜酵母是成品曲中的優勢酵母。傳統分離雖然能夠有效獲得大曲活體菌株，但由于大曲微生物往往適應了高溫、低水分的制曲環境，在人工培養模式下，由于培養環境和條件的不同，會導致微生物可培養性降低，大量具有重要作用的微生物資源被埋沒[7]。近年來，隨著現代分子生物學技術的不斷完善與發展，對大曲中真菌群落結構的研究不再受傳統微生物純培養技術的限制，如變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、高通量測序等分子生物學技術可直接從分子水平研究大曲真菌微生物資源，為大曲真菌群落結構及多樣性解析奠定了堅實的基礎。如譚崇堯等[8]利用高通量測序對不同地域濃香型白酒大曲進行菌群結構研究，結果表明北方派濃香型白酒大曲優勢真菌有熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）等，長江中游派優勢真菌為曲霉屬（Aspergillus）、熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬，江淮派優勢真菌有曲霉屬、熱子囊菌屬、耐干霉菌屬（Xeromyces）等，川派優勢真菌有熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬、曲霉屬等；吳樹坤等[9]利用高通量測序分析了四川不同地區濃香型白酒大曲微生物群落結構，發現大曲中優勢真菌為嗜熱真菌屬、曲霉屬、嗜熱子囊菌屬、絲衣霉屬（Byssochlamys）、節擔菌屬（Wallemia）；施思等[10]利用高通量測序技術研究了濃香型白酒大曲貯藏過程中微生物多樣性的變化，結果發現在貯存過程中大曲真菌群落結構不斷調整，畢赤酵母屬（Pichia）、根霉屬（Rhizopus）及橫梗霉屬（Lichtheimia）成為最終的優勢菌群。

濃香型白酒在我國的白酒消費市場上占據著主導的地位，因此對濃香型白酒大曲中的微生物進行研究，對解析大曲的代謝機理、豐富大曲微生物資源及保證大曲質量具有十分重要的意義。目前，雖然已有濃香型大曲真菌群落組成的相關研究，但多數研究往往采用較為傳統的微生物分離技術及DGGE技術，難以系統確定大曲真菌組成情況，即使部分研究運用了高通量測序，但所研究樣品往往存在數量較少的問題，很難全面反應濃香型大曲真菌真實組成情況。因此，本實驗從四川15家不同濃香型白酒企業采集大曲樣品，利用高通量測序技術分析其真菌群落組成及多樣性，為進一步解析濃香型大曲微生物及微生物篩選等工作提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

大曲樣品：分別采集自四川15家濃香型白酒酒企，編號為NX-1～NX-15，其中樣品NX-1采集自四川巴中，NX-4、NX-6、NX-10、NX-11采集自四川成都，NX-3、NX-7、NX-8、NX-13采集自四川瀘州，NX-2、NX-5采集自四川綿陽，NX-12采集自四川遂寧，NX-9、NX-14、NX-15采集自四川宜賓。樣品采集后砸碎混勻，-80 ℃儲存備用。

1.1.2 主要試劑

三氯甲烷、月桂酸鈉、異戊醇、異丙醇（均為分析純）：上海生工生物工程有限公司；乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、酚（Phenol）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1-14k高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；C1000快速梯度基因擴增儀；Powerpac Basic基礎型水平電泳儀；GelDoc XR+BIO-RAD全自動凝膠成像儀：美國BIORAD公司：Illumina MiSeq測序儀：北京奧維森基因科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲總DNA的提取

從-80 ℃冰箱中各取1 g大曲樣品放入研缽中，倒入液氮，迅速研磨成粉末后轉移到50 mL無菌離心管中，加入10 mL月桂酸鈉緩沖液（5.844 g NaCl，10 g月桂酸鈉，100 mL 1.0 mol/L Tris-HCl，40 mL 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0，定容至1 L），并緩慢搖動離心管15～20 min。加入10 mL苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V），緩慢搖動10 min，12 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min。吸取16 mL上清液至50 mL離心管中，加入12.8 mL異丙醇，上下緩慢顛倒數次，12 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清。加入1 mL體積分數為70%的乙醇反復輕輕振蕩洗滌沉淀，12 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄乙醇。重復上一步驟后，將白色沉淀再次在12 000 r/min、4 ℃條件下短暫離心數秒，用移液槍吸干殘留乙醇，白色沉淀置于37 ℃干燥箱中，烘干后添加0.9 mL TE緩沖液（pH 8.0）溶解脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）[11]。

1.3.2 Illumina MiSeq高通量測序

DNA檢測合格后，送往北京奧維森公司，利用Illumina MiSeq測序平臺對大曲真菌ITS1區基因序列進行測序。測序引物內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）1-F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-TGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。下機數據經拼接、過濾、剔除嵌合體，舍棄低質量序列等。利用USEARCH（v11.0.667）將序列按97%相似度聚類為可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。利用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）在UNITE數據庫（https：//unite.ut.ee/analysis.php）對真菌序列進行分類注釋，獲得有效的OTU分類學信息。

1.3.3 數據分析

利用Mothur（v1.42.1）對序列數進行歸一化處理，計算出稀疏曲線數據、Alpha多樣性指數；基于R語言（3.6.1）分析微生物門、綱、屬組成情況；基于R語言的vegan包進行主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA），進而分析不同濃香型大曲真菌組成情況。

2 結果與分析

2.1 濃香型白酒大曲真菌群落多樣性分析

2.1.1 稀釋曲線

有研究表明，稀釋曲線能夠反應測序深度情況[12]。濃香型白酒大曲樣品真菌菌群的稀釋曲線見圖1。由圖1可知，15份大曲樣品的稀釋曲線隨測序深度的增加呈現先直線上升后緩慢上升直至趨向平坦，說明測序樣品數據量已經能夠反映樣品中絕大多數的微生物菌群信息，再增加測序深度也無法獲得更多的OTU，真菌菌群的多樣性也不會發生改變，所測數據能夠滿足后續實驗分析。

圖1 濃香型白酒大曲樣品真菌菌群稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of fungal community in strong-flavor Baijiu Daqu samples

2.1.2 Alpha多樣性分析

15份大曲樣品的真菌ITS區測序共獲得657 848條真菌序列，按照97%相似度歸類，并進行Alpha多樣性分析，結果見表1。

表1 15份濃香型白酒大曲樣品真菌菌群α-多樣性指數分析結果Table 1 Analysis results of α-diversity indexes of fungal community in 15 strong-flavor Baijiu Daqu samples

由表1可知，15份大曲樣品累計共獲得393個OTU，樣品NX-9的OTU數最高，達到163，樣品NX-6的OUT數最低為52。Goods coverage、Chao1、Shannon指數是Alpha多樣性常用指數，其中Goods coverage指數用來反映測序得到的微生物群落的覆蓋率[13]，15份濃香型大曲樣品的Goods coverage均＞99.79%，說明該實驗測序結果能夠很好地反映樣品中真菌的情況。Chao1指數用于計算物種豐度，其值越大說明樣品的微生物群落的豐度越高，15份大曲樣品中，樣品NX-7的Chao1指數最高，達到308.3，樣品NX-6的Chao1指數最低，僅為65.6。Shannon指數常用于計算菌群多樣性指數，其值越大說明群落多樣性越高，15份大曲樣品中，樣品NX-9的Shannon指數最高，為3.683，樣品NX-7的Shannon指數最低，僅為0.847。結果表明，不同濃香型白酒大曲真菌微生物豐度及群落多樣性存在較大差異。

2.1.3 Beta多樣性分析

為進一步分析不同濃香型白酒大曲真菌群落相似性，本研究基于Bray Curtis距離對測序獲得的OTU進行主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）分析，以反應不同大曲真菌組成相似度，結果見圖2。

圖2 基于OUT 15份濃香型白酒大曲樣品真菌菌群PCoA結果Fig.2 PCoA results of fungal community in 15 strong-flavor Baijiu Daqu samples based on OTU

PCoA常用來研究樣本群落組成的相似性或差異性[14]，各個點之間的距離越大，表明它們之間的菌群差異越大[15]。由圖2可知，PCoA1和PCoA2對樣品差異性方差貢獻率分別為30.16%和17.98%，累計方差貢獻率為48.14%，其余主成分方差貢獻率均低于10%，說明同一香型大曲中，15份大曲樣品真菌組成存在一定差異，但并不明顯。樣品NX-1、NX-3、NX-4、NX-10、NX-11距離較近，樣品NX-2和NX-8距離較近，說明樣品NX-1、NX-3、NX-4、NX-10、NX-11真菌菌群組成相似，樣品NX-2和NX-8真菌組成相似，其余樣品距離較遠，未出現明顯聚類，說明不同酒廠濃香大曲真菌組成之間存在一定差異性。

2.2 濃香型白酒樣品真菌菌群組成分析

基因門、綱及屬水平15份濃香型白酒大曲樣品中真菌群落結構見圖3。由圖3a可知，15份濃香型白酒大曲所檢測到的393個真菌OTU隸屬于6個門19個綱和117個屬。在門分類水平，6個門分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）。其中，子囊菌門在15份大曲中相對豐度較高，達到67.98%～99.48%，毛霉門在樣品NX-9（26.98%）、NX-11（14.62%）和NX-6（11.13%）中相對豐度較高，其余門相對豐度較低。

圖3 基于門（a）、綱（b）及屬（c）水平15份濃香型白酒大曲樣品真菌群落結構Fig.3 Fungal community structure of 15 strong-flavor Baijiu Daqu samples at phylum (a),class (b) and genus (c) level

在綱分類水平上，共有19個綱被檢測到，將相對豐度＜1%及無法歸類的綱合并為others。由圖3b可知，15份大曲樣品中，酵母綱（Saccharomycetes）和散囊菌綱（Eurotiomycetes）的相對豐度較高，二者相對豐度之和達到58.8%～99.1%。另外，Mucoromycetes在樣品NX-9（26.98%）、NX-11（14.62%）、NX-6（11.13%）中也占有較高相對豐度，其余綱相對豐度較低。

在屬分類水平上，共檢測到117個真菌屬，將相對豐度＜1%及無法歸類的屬合并為others。由圖3c可知，15份大曲樣品中真菌菌群出現明顯差異。樣品NX-1、NX-4、NX-11中以嗜熱類真菌的熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）為主，相對豐度較高，兩者相對豐度之和達45.6%～31.3%，同時還含有一定量的覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（18.7%～40.4%）和曲霉屬（Aspergillus）（5.4%～22.4%）。樣品NX-3、NX-10、NX-13、NX-6和NX-14則主要以酵母類的覆膜孢酵母屬和畢赤酵母屬（Pichia）為主，兩者相對豐度之和達到46.4%～83%。樣品NX-5、NX-12、NX-15、NX-7中曲霉屬相對豐度較高，能夠達到50%～89.3%。樣品NX-9中絲狀真菌相對豐度較高，曲霉屬和根毛霉屬（Rhizomucor）相對豐度之和達56.6%。樣品NX-2主要以酵母類的威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）和酵母屬（Saccharomyces）為主，相對豐度之和達到56.9%。樣品NX-8以酵母類的耐堿酵母屬（Galactomyces）和雙足酵母屬（Dipodascus）為主，相對豐度之和能夠達到59%。

結果表明，雖然15份大曲樣品門分類和綱分類較為一致，但真菌屬組成存在較大的差異，絲狀真菌類的Thermoas cus、Thermomyces、曲霉屬、根毛霉屬以及酵母類的酵母屬、覆膜孢酵母屬、畢赤酵母屬、威克漢姆酵母屬、耐堿酵母屬和雙足酵母屬在不同大曲樣品中相對豐度較高。在白酒釀造過程中，絲狀真菌往往能夠分泌多種酶類將原料中的淀粉、脂肪等降解，為酒醅的后期發酵提供多種前體物質。如曲霉屬能夠產生淀粉酶、蛋白酶等，是白酒發酵中淀粉等大分子物質分解的主要動力之一[16-17]。根毛霉屬具有較強的產脂肪酶能力[18]。嗜熱菌屬和嗜熱囊菌屬同屬于嗜熱真菌類，能夠生成具有更高熱穩定性的木聚糖酶、脂肪酶等多種工業用酶類[19-20]。橫梗霉屬具有產α-淀粉酶、葡萄糖苷酶、纖維素酶和半纖維素酶的能力[21-23]。與絲狀真菌相比，酵母類真菌在產香、產酒等方面具有較強作用，酵母屬是白酒釀造過程中的優勢酵母屬之一，能夠產生多種風味酯并貢獻乙醇和其他有機酸[24-25]。畢赤酵母屬、覆膜孢酵母屬、假絲酵母屬是大曲成熟過程中的優勢菌屬之一，在白酒釀造中具有潛在的風味貢獻功能，其中覆膜孢酵母屬具有較高的淀粉酶和糖苷酶活性，能將淀粉或多糖降解為低分子質量糖，最終水解為葡萄糖，在發酵前期起著至關重要的作用，同時覆膜孢酵母屬還能夠生成較多的多元醇，能夠提高白酒純甜感，改進白酒后味[26-28]。威克酵母屬能夠將原料中的前體物質轉化成酯、酸、醇、醛等風味物質，對白酒風味形成有重要作用[29]。耐堿酵母屬、雙足酵母屬在白酒微生物研究中也有報道，但功能性研究較少，如王鵬等[30]在中國白酒發酵過程核心微生物群研究中，將雙足酵母屬列為核心微生物之一；李凱敏等[31]研究表明，耐堿酵母屬是特香型釀造過程中的優勢菌之一，并在底糟中占到較高的比例。

3 結論

通過高通量測序分析發現，15份濃香型白酒樣品中真菌群落的豐度和多樣性存在較大差異，其中樣品NX-1、NX-3、NX-4、NX-10、NX-11真菌組成相似，樣品NX-2和NX-8真菌組成相似，其他樣品真菌組成差異較大。15份大曲樣品中共檢測到393個操作分類單元（OTU），隸屬于6個門19個綱和117個屬，其中子囊菌門（Ascomycota）、酵母綱（Saccharomycetes）和散囊菌綱（Eurotiomycetes）在15份大曲樣品中的相對豐度均較高。在屬分類水平上，15份大曲樣品出現明顯差異，樣品NX-1、NX-4、NX-11中的熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces），樣品NX-3、NX-10、NX-13、NX-6和NX-14中的覆膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、畢赤酵母屬（Pichia），樣品NX-5、NX-12、NX-15、NX-7中的曲霉屬（Aspergillus），樣品NX-9中的曲霉屬和根毛霉屬（Rhizomucor）、樣品NX-2中的威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、酵母屬（Saccharomyces），及樣品NX-8中的耐堿酵母屬（Galactomyces）和雙足酵母屬（Dipodascus）相對豐度較高。本研究能夠在一定程度上豐富人們對四川濃香型白酒大曲真菌菌群的認識，為進一步濃香型白酒大曲優勢真菌微生物功能性研究及特色菌株應用提供一定理論支撐。