凱里地區辣椒酸細菌群落多樣性及其乳酸菌分離鑒定

李 潔，崔霖蕓，陳芳勇，宮路路

（遵義醫藥高等專科學校 醫學技術系，貴州 遵義 563000）

辣椒酸又稱為辣椒紅酸湯，是貴州黔東南地區苗族、侗族等民族常見的傳統發酵食品。辣椒酸以辣椒為主要原材料，經傳統自然發酵而成，是制作凱里紅酸湯的半成品；可與番茄紅酸湯按照一定比例混合，經二次發酵便可制成凱里紅酸湯[1]。研究發現，酸湯具有生津止渴、清熱解毒、健脾開胃和促進消化等功能[2]。在黔東南地區有著“三天不吃酸，走路打串串”的說法[3]。凱里地區為酸湯主要食用地區，有著悠久的歷史。2012年，經國家質檢總局批準，“凱里紅酸湯”正式成為地理標志保護產品。

目前，酸湯中微生物研究漸漸成為熱點。如酸湯中優勢微生物分離[4-5]，酸湯中微生物多樣性分析[6-8]、乳酸菌發酵酸湯品質變化研究[9]，酸湯微生物發酵風味物質檢測[10]，酸湯微生物發酵工藝研究[11-12]，酸湯口服液和飲料產品開發利用[13-14]、酸湯對高脂血癥大鼠血脂以及腸道影響[13，15]、微生態制劑對斷奶仔豬腸道微生物影響[16]等。本研究借助發展成熟的Illumina MiSeq高通量測序技術，對凱里傳統發酵辣椒酸及其工業化成品進行研究。利用乳酸菌常用MRS培養基從辣椒酸中篩選優勢乳酸菌，以期為研究酸湯發酵工藝以及酸湯產品開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5份傳統發酵成熟階段的辣椒酸樣品：從凱里市東門街農貿市場、金玉農貿市場、開發區農貿市場以及鴨塘鎮農貿市場采集，分別編號為ST8、ST11、ST17、ST23和ST25；某品牌辣椒酸樣品1份（對照）：市售，出廠前已進行滅活處理，編號為ST21。每個樣品采集時取30 mL，裝入50 mL無菌離心管，并置于便攜式冰盒中進行攜帶。樣品隨即運至昆明理工大學生命科學與技術學院應用微生物實驗室于4 ℃冰箱暫存待用。

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取裂解緩沖液，TE緩沖液[24]；玻璃珠（直徑212～300 mm）：美國Sigma公司；PremixExTaqTM（2×）：日本TaKaRa公司；QIAquick gel Extraction Kit試劑盒：德國Qiangen公司；MRS培養基：北京鼎國生物技術有限公司；蔗糖、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、瓊脂糖：上海生工生物工程有限公司；甘油：天津試劑三廠。上述試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

SX-300高壓滅菌鍋：日本TOMY Digital Biology公司；GHP-9160恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SWCJ-1FD超凈工作臺：蘇凈安泰公司；ABI 7200 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；Roche_454羅氏GS-FLX測序儀：瑞士Roche公司；Labnet230V EU渦旋儀：美國Labnet公司；SIGMA 3-18K高速離心機：德國Sigma公司；YP1002N電子天平：上海恒平科學儀器有限公司；ADW-B純水儀：美國艾科浦國際有限公司；GL-3250A磁力攪拌器：麒麟貝爾儀器制造有限公司；Ultrospec 2100 pro紫外分光光度計：安瑪西亞（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣椒酸樣品細菌宏基因組DNA提取

稱取辣椒酸樣品500 mg，參考文獻[17]的方法進行改良[18]，對樣品細菌總基因組DNA進行提取。將提取的DNA置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 細菌16S rDNA目的基因擴增和高通量測序

使用細菌16S rDNA通用引物，擴增高變區V2-V4區域。引物序列如下：

338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）

806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）

以1.3.1中提取DNA為模板，對細菌16S rDNA V2-V4區進行PCR擴增。PCR擴增體系：Premix ExTaqTM聚合酶10 μL，模板基因組DNA0.5 μL，目的基因上下游引物各1 μL，雙蒸水（ddH2O）8 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 s，循環30次后；72 ℃延伸5 min。

吸取上述PCR擴增產物5 μL，用去離子水稀釋10倍，按照原反應條件進行5個循環，以減少PCR產物的非特異性擴增[19]。PCR產物用QIAquick gel Extraction Kit試劑盒進行純化回收，并使用分光光度計定量，使用Illumina Miseq高通量測序技術對PCR產物進行測序[20]。

1.3.3 測序結果分類鑒定

根據barcode將測序序列分配到對應樣品中，去除barcode以及引物序列得到有效序列。使用mothur v1.43.1軟件包Miseq SOP進行序列拼接，去除質量欠佳序列，保留長度大于400 bp的序列。運用mothur v1.43.1軟件classify.seqs命令進行分析，結合Silva的SSU rRNA序列數據庫V138分類信息進行分析[21]，得到序列分類數據。

1.3.4α多樣性指數分析

使用mothur中classify.seq命令獲得樣品中微生物群落結構，使用rarefaction.single命令得到微生物Chao1和ACE等指數。以序列相似度為97%劃分可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。根據以上結果計算樣品ACE指數、Chao1指數、Shannon指數以及Coverage等。并根據Rarefaction文件繪制Rarefaction曲線。

1.3.5 辣椒酸中乳酸菌分離

采用倍比稀釋涂布法分離辣椒酸中的乳酸菌。在超凈工作臺中吸取辣椒酸樣品1 mL，經無菌生理鹽水梯度稀釋后，吸取20 μL稀釋度為10-6的稀釋液涂布于MRS瓊脂平板表面。待菌液吸收后，將平板倒置于恒溫培養箱中35 ℃靜置培養24 h。觀察培養菌落形態，挑取具有不同形狀、大小以及顏色的單菌落進行2～3次劃線分離。結合過氧化氫實驗和革蘭氏染色實驗，選取過氧化氫陰性、革蘭氏染色陽性的菌株，加入30%甘油置于-80 ℃冰箱保存[22]。

1.3.6 辣椒酸中乳酸菌分子生物學鑒定

以改良十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取1.3.5中分離到的乳酸菌基因組DNA，利用細菌16S rRNA通用引物進行PCR擴增。

引物序列：F27（5'-AGAGTATGATCATGGCTCAG-3'），R1492（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）

擴增體系：ExTaq25.0 μL，F27和R1492引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 21.0 μL。按照程序95 ℃熱變性30 s；60 ℃變性1 min，72 ℃延伸150 s，循環35次后；72 ℃延伸10 min。以便得到足夠數量的目的DNA分子。

采用雙脫氧鏈終止法進行序列測定。所得測序核苷酸序列提交美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），利用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）與Genebank中已知的16S rDNA核苷酸序列進行同源性比較，當被檢菌株核苷酸序列與參考菌株同源性大于97%時，即確定為同一個菌種[23]。

1.3.7 乳酸菌代表菌株系統發育分析

選取樣品ST8中分離的ST8-4、ST8-7、樣品ST11中分離的ST11-7、樣品ST17中分離的ST17-2、以及樣品ST23中分離的ST23-10、ST23-11和ST25-1作為代表菌株。將代表菌株的16S rDNA核苷酸測序結果登錄NCBI網站進行BLAST序列同源性比對，選取同源性較高的菌株構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 樣品序列信息和α多樣性分析

由表1可知，6個辣椒酸樣品（ST8、ST11、ST17、ST21、ST23、ST25）由Illumina MiSeq測序共得到22 605個有效序列，553個OTUs其Coverage分別為93%、96%、93%、91%、96%和92%，樣品覆蓋度比較高，均在90%以上。樣品ST17的ACE指數和Chao1指數最高，分別為2 936.468和1 136.115；說明其物種豐度最高。ST21的序列數、OTUs數目以及Shannon指數最高，分別為4 500、148和3.802；說明其物種多樣性在所有樣品中最高。可見，各個樣品之間微生物多樣性以及豐度存在一定差異。

表1 不同樣品中細菌菌群的α多樣性指數Table 1 Alpha diversity index of bacterial community in different samples

根據Rarefaction數據繪制Rarefaction稀釋曲線，結果見圖1。當cutoff值為0.03時，樣品ST17曲線處于上升趨勢。但從表1的Coverage可看出，樣品中細菌序列的覆蓋度達到了90%以上。說明該樣品在發酵過程中起主要作用的微生物已得到分析，物種測序深度已經足夠。其余5個辣椒酸樣品Rarefaction稀釋曲線趨于平緩，說明其測序深度充分，基本可覆蓋到樣品中的所有物種。

圖1 序列相似度為97%細菌Rarefaction評估Fig.1 Rarefaction evaluation of bacteria with 97% sequence similarity

2.2 門水平細菌多樣性分析

從門水平對辣椒酸中細菌群落多樣性進行分析，結果見圖2。從圖2可知，辣椒酸中優勢細菌門依次為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、類桿菌門（Bacteroidota）和Actinobacteriota，平均相對含量分別為77.9%、19.59%、1.21%和0.95%；其余細菌門相對含量均＜0.1%。

圖2 基于門水平辣椒酸中細菌群落結構分析Fig.2 Analysis of bacterial community structure in peper acid based on phylum level

其中厚壁菌門（Firmicutes）在樣品ST11和ST23中占絕對優勢，相對含量分別為95.19%和97.66%。該細菌門在樣品ST8和ST17中相對含量也較高，為83.33%和88.66%；在樣品ST21中相對含量稍低，為49.38%；除了在樣品ST25中，厚壁菌門（Firmicutes）在每個樣品中相對含量均超過或接近50%。可見厚壁菌門（Firmicutes）為辣椒酸中的優勢菌門。樣品ST25中，厚壁菌門（Firmicutes）相對含量為24.54%，在所有樣品中含量最低；而變形菌門（Proteobacteria）在該樣品中相對含量為69.01%，在所有樣品中含量最高。樣品ST8、ST17和ST21中變形菌門（Proteobacteria）相對含量也比較高，分別為13.66%、10.41%和43.71%；另外兩個樣品ST11和ST23中相對含量最低，分別為3.03%和2.01%。可見變形菌門（Proteobacteria）細菌門在不同辣椒酸中相對含量差異很大。

王琪琪等[6]對辣椒紅酸湯（即辣椒酸）中微生物多樣性研究發現，厚壁菌門（Firmicutes）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）為樣品中的優勢菌門。而本研究也發現了大量藍藻細菌門（Cyanobacteria）的序列，但考慮到其序列為葉綠體的[24]，即辣椒酸發酵時加入新鮮紅辣椒所致。因此，并未歸為樣品細菌門當中。

2.3 屬水平細菌多樣性分析

從屬水平對辣椒酸中細菌群落多樣性進行分析，見圖3。總體上，辣椒酸樣品中相對含量＞1%的屬有乳酸桿菌（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬屬（Enterobacter）、Lelliottia、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas），一共7個屬，平均相對含量分別為72.02%、5.59%、3.97%、5.30%、1.64%、1.07%和1.02%。可見，各樣品中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）相對含量最高。單個樣品中，樣品ST8、ST11、ST17、ST21和ST23，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為優勢菌屬，相對含量分別為67.74%、95.09%、83.95%、38.34%和95.01%。從乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對含量可看出，樣品ST11（95.09%）和ST23（95.01%）中該細菌屬占絕對優勢，樣品ST17（83.95%）次之，樣品ST25（1.81%）中最低。而假單胞菌屬（Pseudomonas）和Lelliottia細菌屬在樣品ST25中相對含量較高，分別為27.23%和11.79%，該樣品的細菌多樣性和豐度比較分散。從以上數據可以看出乳酸桿菌（Lactobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）為辣椒酸中的優勢菌屬，與王琦琦等[6]研究結果一致。

圖3 基于屬水平辣椒酸中細菌群落結構分析Fig.3 Analysis of bacterial community structure in peper acid based on genus level

乳酸桿菌屬（Lactobacillus）作為乳酸菌中最大的一個屬，在人和動物腸道中維持著腸道的微生態平衡。同時有研究表明酸湯在改善胃腸道方面具有保健功能[4]。在辣椒酸樣品中，存在著大量的假單胞菌屬（Pseudomonas）和少量的葡萄球菌屬（Staphylococcus）。報道指出，隸屬于金黃色葡萄球菌屬（Staphylococcus aureus）[25]和銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas aeruginos）[26]部分“種”對人體產生一定的條件致病性。因此，在制作傳統發酵酸辣椒時需注意生產環境的影響作用。

2.4 乳酸菌鑒定結果

結合Illumina MiSeq高通量測序數據，在分析辣椒酸樣品屬分類水平細菌多樣性時發現乳酸菌相對含量很高。為進一步探明辣椒酸中的優勢乳酸菌類群，利用MRS合成培養基對辣椒酸樣品中乳酸菌進行分離培養，結果表明，從辣椒酸樣品中一共分離出了43株細菌。分別為34株乳酸菌、6株芽孢桿菌和3株葡萄球菌，分別占分離菌株的79.07%、13.95%和6.98%。其中分離出的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）最多，一共20株，該菌被認為是影響泡菜感官品質的重要菌之一[27]；其他分別為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）5株、枯草桿菌（Bacillussp.）4株、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）3株、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和白色芽孢桿菌（Bacillus albus）各2株。戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、乳酸桿菌（Lactobacillussp.）、葡萄球菌（Staphylo coccussp.）、免培養葡萄球菌（UnculturedStaphylococcussp.）、假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）、巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）和免培養乳酸桿菌（UnculturedLactobacillus）各1株。根據各樣品名稱，將其對應分離的菌株進行命名，其鑒定結果見表2。

表2 篩選菌種鑒定結果Table 2 Identification results of screened strains

樣品ST8中分離出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）14株，戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）1株。向凡舒等[28]從酸豇豆中分離得到12株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）占分離菌株的92.3%，該菌在蔬菜發酵過程中起到重要的作用。徐莉等[29]研究發現植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可有效抑制酸湯中雜菌的生長，可縮短發酵反應進程，影響酸湯風味。田永峰[4]從紅酸湯中分離出4株桿菌，研究發現乳桿菌影響酸湯的營養價值和風味。在酸湯發酵后期乳桿菌產生大量乳酸，可迅速降低發酵環境的pH，抑制其他菌群生長，乳桿菌成為最后的優勢菌群。

樣品ST11中分離出植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）6株，乳酸桿菌（Lactobacillussp.）、葡萄球菌（Staphylococcussp.）、免培養葡萄球菌（UnculturedStaphylococcus sp.）和假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）各1株。其中葡萄球菌（Staphylococcussp.）和免培養葡萄球菌（UnculturedStaphylococcussp.）多數為非致病菌，但少數可導致疾病。提示傳統發酵食品中潛藏著一定的食品安全風險，需引起重視。

樣品ST17分離出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）2株。樣品ST21為工業化辣椒酸成品，未分離出乳酸菌。顯然產品在出廠前進行了活菌滅活處理[30]，用以保持產品風味穩定性和常溫保存時延長產品貨架期。樣品ST23中分離出副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）5株、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）3株、巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）和免培養乳酸桿菌（UnculturedLactobacillus）各1株；樣品ST25分離出芽孢桿菌（Bacillussp.）4株，白色芽孢桿菌（Bacillus albus）2株。從以上辣椒酸中微生物分離結果可看出，不同樣品中分離出的細菌種類和數量基本都不相同。不同微生物在辣椒酸發酵時產生不同的產物，造就了辣椒酸的不同風味。

續表

2.5 代表菌株系統發育分析

將隨機挑選同一個菌種名稱的菌株作為代表菌株ST8-4、ST8-7、ST11-7、ST11-10、ST17-2、ST23-10、ST23-11和ST25-1菌株的16S rRNA核苷酸序列提交NCBI數據庫進行同源性比對，并構建系統發育樹，如圖4所示。發現菌株ST8-7與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）8m-21呈現出較高的相似度；菌株ST8-4與戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）CE14.15呈現出較高的相似度；菌株ST11-7和ST11-10與乳酸桿菌（Lactobacillussp.）THK-W4呈現出較高的相似度；菌株ST17-2與短乳桿菌（Lactobacillus brevis）gp107呈現出較高的相似度；菌株ST23-10h與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）呈現出較高的相似度；菌株ST23-11與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）6664呈現出較高的相似度；菌株ST25-1與枯草桿菌（Bacillussp.）Pg 15呈現出較高的相似度。

圖4 代表菌株基于16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of representative strains based on 16S rRNA gene sequence

3 結論

本研究結合Illumina MiSeq高通量測序技術和傳統純培養技術對凱里地區辣椒酸中微生物群落多樣性進行分析。發現凱里地區辣椒酸中優勢門為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），所占比例最大的優勢屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。利用MRS培養基，采用純培養技術分離出的細菌多為乳酸桿菌，部分為芽孢桿菌以及少數葡萄球菌；且不同樣品分出的細菌種類基本不同。可能與辣椒酸生產環境以及生產工藝的不同相關。純培養分離的細菌當中以植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）為主。由此可見，凱里地區辣椒酸中含有豐富的乳酸菌資源，有待進一步的開發利用。