一株源于北派醬香白酒釀造環境中產淀粉酶細菌的篩選、鑒定及其特性研究

秦立芹，馬景浩，李二浩，周 陽，楊博思，朱宇婷，吳秋華，田進英，李秀婷，4，范光森*

（1.北京工商大學 食品與健康學院，北京 100048；2.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048；3.北京華都釀酒食品有限責任公司，北京 102212；4.北京工商大學，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100048）

白酒是中國的國酒，是一種歷史悠久的蒸餾酒，因其獨特的固態釀造方式成為我國傳統釀造食品中的典范，在中國飲食文化中占有重要地位[1-2]。傳統白酒釀造是以富含淀粉基質的高粱、玉米和大米等為原料，采用邊糖化邊發酵的“雙邊發酵”方式協同進行，再經過蒸餾、勾調和貯存等過程釀制的富含千種風味物質的酒精類飲品[3]。在白酒釀造過程中，“雙邊發酵”中的糖化和發酵協調一致、有序進行是白酒釀造成功的關鍵，決定了白酒的出酒率和豐富度[4]。如糖化作用不足，原料中的淀粉轉化為可發酵的糖量不充分，從而影響酵母的發酵，導致原料利用率差，出酒率低[5]。高產淀粉酶菌株往往具有高糖化作用，對于提高白酒出酒率和縮短白酒釀造周期具有重要的作用。為此，有研究者針對白酒釀造環境中高產淀粉酶菌株開展了研究，獲得了多株具有提高白酒出酒率等應用潛力的優良菌株[6]。眾所周知，霉菌是重要的淀粉酶產生菌株，在白酒釀造糖化過程中發揮一定作用，是眾多研究者篩選白酒釀造環境中高產淀粉酶的重要關注菌群，這也是有關白酒釀酒中高產淀粉酶菌株相關研究主要集中于霉菌的原因[7]。然而，在白酒釀造過程中，細菌菌群具有更高的豐度和多樣性，是白酒釀造更為有力的主導者，加強白酒釀造環境中細菌功能的研究將會有助于白酒品質的進一步提升，尤其是對其所產酶能力的探究[8]。因此，已有研究者將研究白酒釀酒環境中高產淀粉酶的菌株聚焦于細菌，篩選出多株高產淀粉酶的細菌[9-10]。

醬香型白酒是白酒的基本香型之一，具有“醬香突出，幽雅細膩，酒體醇厚，回味悠久，空杯留香”的酒體風格，深受消費者的喜愛[11]。其中，以茅臺為代表的醬香型白酒因其獨特的品質而廣受好評，因此，在1975年“八大名酒進北京”時，北京華都釀酒食品有限責任公司沿襲和創新了茅臺醬香型白酒的釀造工藝，開啟了一段南醬北傳的歷史傳奇，成為北派醬香的先河，也奠定了華都在北派醬香中的歷史地位。但畢竟南北方的氣候和環境差異很大，微生物區系也有較大差異[12]，因此，以華都為代表的北派醬香型白酒在釀造過程上也因地制宜進行了創新，從而釀造出了獨具一格的北派醬香型白酒，如“下沙”時間段相比茅臺釀造工藝的“下沙”時間段后移，以此將釀造好酒的3～5輪次安排在最接近南方炎熱且潮濕氣候的7～9月；冬季寒冷季節通過供暖系統提高釀造環境溫度等。為進一步提升北派醬香白酒的品質，北京華都釀造食品有限責任公司嘗試通過挖掘釀造環境中微生物的功能，以白酒釀造驅動力-微生物作為進一步深化改革的靶點。因此，本研究正是基于此，采用平板涂布方法結合淀粉瓊脂篩選培養基透明圈法從其釀造環境（大曲、酒醅和窖泥）中篩選高產淀粉酶菌株，并通過形態和細胞觀察、生理生化試驗結合分子生物學方法對其進行鑒定，同時探究其在不同條件下的菌體生長情況分析其生長特性和環境耐受性，以此進一步解決因冬季寒冷，入窖溫度低，糖化作用低的問題。本研究將有助于了解華都釀造食品有限責任公司白酒釀造環境中產淀粉酶細菌微生物情況，為后續利用功能微生物強化方法提高其出酒率提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

大曲、酒醅和窖泥：2020年8月取自北京華都釀酒食品有限責任公司釀造車間；可溶性淀粉：美國Sigma公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylicacid，DNS）：國藥集團化學試劑有限公司；淀粉酶（2萬U/mL）：上海麥克林生化科技有限公司；糖化酶（10萬U/mL）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產生化試劑或分析純。

1.1.2 培養基

LB固體培養基：氯化鈉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，瓊脂粉20 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

淀粉瓊脂篩選培養基：牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，瓊脂粉20 g/L，可溶性淀粉20 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：可溶性淀粉1 g/L，蛋白胨1 g/L，（NH4）2SO40.25 g/L，MgSO40.02 g/L，FeSO4·7H2O 0.002 5 g/L，KH2PO40.3 g/L，CaCl2·6H2O 0.025 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min，FeSO4·7H2O滅菌后過膜加入。

高粱酶解液培養基：參照FAN G S等[13]方法進行制備。

1.2 儀器與設備

BSA124S電子天平、PB-10 pH計：賽多利斯科學儀器有限公司；YQX-SG46-280S立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；BCN-1360型生物潔凈工作臺：北京東聯哈爾儀器公司；LHS-100CL恒溫恒濕培養箱：上海一恒儀器設備有限公司；TU-19紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；CKX41-F32FL倒置熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司；Tprofessional 聚合酶鏈式反應（polymeras chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；Microfuge2R離心機：北京田林恒泰科技有限公司；TSQTM8000 evo三重四級桿氣質聯用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）儀：美國ThermoFisherScientific公司；ZQZY-C8V振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的篩選和分離

用無菌水將曲粉、窖泥或酒醅樣品稀釋成10-5、10-6和10-7的菌懸液，取100 μL菌懸液涂布于LB平板上，倒置培養于30 ℃，隨時觀察并挑取菌落形態特征明顯不同的單菌落，采用分區劃線法進行分離純化，純化菌株保藏于4 ℃備用。

1.3.2 產淀粉酶菌株的篩選

將篩選得到的菌株分別點種于淀粉瓊脂篩選培養基上，于30 ℃倒置培養48 h，用少量碘液鋪平平板后，靜置1 min，觀察菌落周圍有無透明圈，若有透明圈，則表明菌株能產生淀粉酶根據透明圈直徑（D2）與菌落直徑（D1）的比值（D2/D1）的大小判斷菌株產淀粉酶的能力。

1.3.3 菌株的鑒定

形態觀察：將高產淀粉酶菌株接種至LB固體培養基上，30 ℃條件下培養2 d后進行菌落形態觀察；挑取LB平板上單菌落少量菌體，涂布并固定在載玻片上，進行革蘭氏染色及芽孢染色，采用油鏡（10×100倍）觀察，記錄細胞形態情況[14]。

生理生化實驗：菌株生理生化分析參照《伯杰細菌鑒定手冊》[15]，包括糖發酵、碳源同化、氮源同化、淀粉水解試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗、尿素試驗、硫化氫試驗、牛奶石蕊試驗、V.P.試驗、明膠液化試驗和檸檬酸鹽試驗。

分子生物學鑒定：采用細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒提取初篩獲得的高產淀粉酶菌株的基因組DNA，并以該DNA為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rRNA基因的PCR擴增。PCR反應體系為：37.5 μL雙蒸水（ddH2O），4 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs），1 μL上游引物（27F），1 μL下游引物（1492R），1 μL總DNA，0.5 μLTaqDNA聚合酶，5 μL 10×Buffer。PCR反應條件為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次；72 ℃再延伸10 min。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京諾賽基因組研究中心有限公司測序，測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對，使用MEGA 7.0生物學軟件對近似序列進行比對分析，利用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 菌株生物學特性研究

菌株生物學特性研究參照之前研究報道[16]，主要包括生長溫度范圍、pH值范圍、乙醇耐受性、葡萄糖耐受性、NaCl耐受性和己酸耐受性。

1.3.5 菌株產淀粉酶測定

菌株于LB液體培養基中進行活化（37 ℃、180 r/min條件下培養18 h）后，按照1%（V/V）的接種量接種于發酵培養基中于37 ℃、180 r/min條件下培養5 d，每天測定淀粉酶活力和生物量。

淀粉酶活力采用DNS法進行測定[17]，淀粉酶活力單位定義為：在上述反應條件下，每分鐘生產1 μmol葡萄糖所需要的酶量為一個酶活單位（U/mL）。

生物量采用分光光度計于波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值）。

1.3.6 菌株產香特性

菌株按照1.3.5中方法進行活化后，接種于高粱酶解液中進行產香特性分析，培養條件為37 ℃、180 r/min培養48 h，采用頂空固相微萃取-氣質聯用（solid-phase micro-extractiongas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法檢測其所產揮發性風味物質。參照FAN G S等[18]的方法并采取一定修改測定菌株在高粱酶解液中培養所產揮發性成分，具體參數如下：發酵液裝入頂空瓶中50 ℃平衡30 min，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附30 min，于氣相色譜高溫氣化室解吸5 min后進行氣質分析。

GC條件：毛細管色譜柱為DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm），不分流進樣，進樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣（He），流速為1mL/min，程序升溫：40℃，保留3min，以2℃/min的速率升至100 ℃，保留5 min，再以2 ℃/min升至150 ℃，穩定3 min，最后以10 ℃/min升至280 ℃，穩定6 min。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描范圍35～400 amu，離子源溫度250 ℃，接口溫度250 ℃。

定性定量方法：通過質譜解析與NIST 11譜庫和文獻保留指數比對確定各化合物結構，并采用四辛醇作為內標進行內標半定量法計算各化合物的含量。

1.3.7 數據處理

每組試驗進行三個平行，數據采用“平均值±標準差”表示，利用Excel 2016處理試驗數據。

2 結果與分析

2.1 產淀粉酶菌株篩選

通過梯度稀釋結合平板涂布方法先后從大曲、酒醅和窖泥樣品中分離出127株菌株（分別編號為2-1～2-15，3-1～3-25，4-1～4-25，5-1～5-8，7-1～7-19，12-1～12-19，17-1～17-16；其中從大曲中篩選獲得16株，從酒醅中分離獲得96株，窖泥樣品中分離出15株）。將上述127株菌分別接種到淀粉瓊脂篩選培養基中培養48 h后，用碘液染色，觀察有無透明圈，代表菌株結果見圖1。測定每株菌株形成的透明圈直徑和菌落直徑，并計算兩者的比值，試驗結果見表1。

圖1 淀粉酶產生菌株的篩選Fig.1 Screening of amylase-producing bacteria

表1 分離菌株透明圈直徑與菌落直徑比Table 1 Transparent circle diameter and colony diameter ratio of isolated strains

續表

由表1可知，在所篩選菌株中，將近40%菌株能產生透明圈，這可能與生長環境有關，是富含淀粉的釀造環境選擇和富集的結果。在這些能產生透明圈的菌株中，其比值差異比較大，表明其所產淀粉酶活力存在一定差異，這主要是由于不同菌株的遺產特性決定的，也正是這些微生物之間存在類似于淀粉酶活力等生物活性的差異，才會促使不同白酒釀造微生物菌群之間巧妙的有機結合，相互促進、協調和制衡，形成符合其釀造工藝特有的菌群演替規律，最終獲得對應釀造環境和生產工藝的產品[19]。相比茅臺酒廠，北京華都釀酒食品有限責任公司釀造車間中高產淀粉酶的菌株相對較少，其比值達到1.50以上的菌株僅9株，其中，以菌株2-2的比值為最大，為2.25，為此將其確定為本研究的目標菌株[20]。

2.2 菌株2-2的鑒定

2.2.1 菌株2-2的形態特征

由圖2a可知，菌株2-2在LB鑒定平板上的生長菌落呈白色不透明狀，表面褶皺，邊緣不規則，內部濕潤不易挑起；由圖2b可知，菌株2-2革蘭氏染色結果呈陽性；由圖2c可知，顯微鏡下菌株2-2細胞形態為桿狀，鏈狀排列，可形成芽孢，呈橢圓形，兩端鈍圓，芽孢囊不膨大，屬典型細菌特征。根據菌株2-2的菌落形態和細胞形態初步確定菌株2-2為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 菌株2-2在LB培養基上菌落形態特征（a）及細胞形態特征（b,c）Fig.2 Colony morphological characteristics on LB culture medium (a)and cell morphological characteristics (b and c) of strain 2-2

2.2.2 菌株2-2的生理生化試驗結果

從表2可以看出，菌株2-2能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖發酵產酸不產氣，但不能利用乳糖、半乳糖、棉子糖、甘露糖、山梨糖、木糖和海藻糖產酸或產氣；碳源同化試驗表明該細菌能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、棉子糖、甘露糖、山梨糖、木糖和海藻糖等碳源生長；氮源同化試驗結果表明，該細菌能利用尿素、硝酸鉀、硫酸銨、L-苯丙氨酸和L-賴氨酸作為唯一氮源進行生長；硫化氫試驗、吲哚試驗、甲基紅試驗和檸檬酸鹽試驗均為陰性反應；V.P.試驗、淀粉水解試驗、尿素酶試驗和明膠水解試驗均為陽性反應，石蕊牛乳試驗表明該細菌能夠產生蛋白酶水解牛乳且具有還原性，能夠使石蕊還原。根據《伯杰細菌鑒定手冊》，該細菌與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的生理特性相似度最高，初步認為菌株2-2屬于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

表2 菌株2-2的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain 2-2

2.2.3 菌株2-2的分子生物學鑒定

菌株2-2的系統發育樹見圖3。由圖3可知，菌株2-2與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）及貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）AJAS1的16S rDNA序列同源性最高，相似度達到99%。綜合菌落形態、細胞形態、生理生化和分子生物學的試驗結果，菌株2-2被鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖3 基于16S rDNA序列菌株2-2的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 2-2 based on 16S rDNA sequences

2.3 菌株2-2生物學特性分析

2.3.1 生長溫度

白酒釀造時溫度范圍變化較大，溫度的適當升高有利于糖化的進行，但過高的溫度也會導致細胞代謝能力的降低，影響酶的活性[21]。

由圖4可知，菌株2-2在25～50 ℃的溫度范圍內都可以生長，在30～40 ℃的溫度范圍內長勢良好，且其最適生長溫度為30 ℃。這表明菌株2-2能夠很好的適應糖化過程中溫度的變化，切合北方地區白酒釀造環境中溫度的變化，表明其在北方地區的白酒釀造過程中具有很好的實際應用價值。

圖4 菌株2-2在不同溫度下的生長情況Fig.4 Growth situation of strain 2-2 at different temperature

2.3.2 生長pH值

環境pH值會對菌株的生長代謝產生一定影響[22]。在白酒發酵過程中，原料中的淀粉和蛋白質等營養物質的分解會產生有機酸、氨類化合物或其他產物，從而導致釀造環境pH的變化[23]，這就要求菌株具有較為寬廣的pH值適應范圍，從而適應發酵過程中pH值的變化。由圖5可知，菌株2-2在pH值4～10的范圍內都可以生長，且在pH值5～9時生長旺盛，有較好的pH值適應性。因此可以在白酒釀造環境中存活且發揮其糖化作用。

圖5 菌株2-2在不同pH值下的生長情況Fig.5 Growth situation of strain 2-2 at different pH

2.3.3 乙醇耐受性

菌株的耐乙醇能力在發酵白酒的過程中是非常重要的，因為白酒釀造過程中產生的乙醇會抑制細胞的正常代謝，對其繁殖也會造成一定程度的影響[24]。由圖6可知，隨著乙醇體積分數的增加，菌株2-2的生長速率下降，但在乙醇體積分數為12%時，菌株2-2還能夠生長，說明其具有較高的耐乙醇能力。在乙醇體積分數10%的范圍內，菌株2-2都有很好的生長，這使得該菌株能夠更好的在釀造環境中發揮作用，發揮糖化力，從而有利于出酒率的提升。

圖6 菌株2-2的乙醇耐受性Fig.6 Ethanol tolerance of strain 2-2

2.3.4 葡萄糖耐受性

淀粉酶在白酒釀造過程中主要起糖化作用，水解釀造原料中的淀粉為后續的發酵生產乙醇提供原料，但是過高濃度的糖產生的高滲透壓會導致細胞內水分的流失，對菌株自身具有一定的危害作用[25]，因此能夠適應高糖環境的菌株對于糖化過程是有利的。由圖7可知，隨著葡萄糖質量分數在0～80%的范圍內增加，逐漸形成的高滲透壓會對細菌細胞產生抑制作用，從而導致生長速率的下降，但菌株2-2在葡萄糖質量分數為70%時還可以生長，表明具有較強的葡萄糖耐受性，這一特征進一步表明了其在白酒釀造中具有潛在的提高白酒產率的應用價值。

圖7 菌株2-2的葡萄糖耐受性Fig.7 Glucose tolerance of strain 2-2

2.3.5 NaCl耐受性

NaCl濃度越高，產生的滲透壓越大，從而會引起細胞內水分活度、細胞結構及組成成分的變化，甚至會降低細胞中酶的活性。微生物的種類不同，其所能適應的滲透壓也不同，具有高滲透壓耐受性的微生物細胞內會形成多種具有特殊功能的酶，來適應環境的變化[26-27]。由圖8可以看出，隨著NaCl質量分數在0～30%的范圍內增加，菌株2-2生長速率會受到一定程度的抑制，但其耐受NaCl的質量分數可以達到15%，說明菌株2-2具有較好的耐鹽性。這可能是在復雜的白酒釀造環境中自然選擇而來的，有利于其快速適應白酒釀造環境。

圖8 菌株2-2的NaCl耐受性Fig.8 NaCl tolerance of strain 2-2

2.3.6 己酸耐受性

白酒在釀造過程中會產生很多風味物質，如醇類、酯類等，其中短鏈有機酸物質在這一過程中會大量積累，同時酸類也是產生酯類的前體物質，但有機酸含量過高也會對細胞產生毒害作用，從而影響到白酒的品質，基于此考察了菌株的己酸耐受性。由圖9可知，己酸體積分數＜0.02%時，有利于菌株2-2的生長，但是隨著己酸添加量的增加，其生長受到影響，當己酸體積分數為0.06%時，菌株已不能生長，由此可見，該菌株具有一定的己酸耐受性，可能在白酒釀造中發揮著將己酸轉化為己酸乙酯的作用。

圖9 菌株2-2的己酸耐受性Fig.9 Caproic acid tolerance of strain 2-2

2.4 菌株2-2的產酶特性

菌株2-2在37 ℃的條件下培養5 d，每隔24 h取樣進行酶活測定和生物量測定，產酶結果如圖10所示。由圖10可知，淀粉酶的活力隨著發酵時間的延長先增加后降低，在第3天達到最大值，為18.7 U/mL。由圖10亦可知，前2 d菌體生長較慢，可能處于延遲期，因此產酶較弱，第3天時菌體生長較快，產酶能力也隨之加強，在第3天到第4天時，菌體量迅速增加。通過比較菌體量和淀粉酶活力的變化，在菌體量較高時，淀粉酶活力反而降低，這可能是由于該菌株所產蛋白質酶所致，也正是由于微生物所產酶系的不斷變化才產生了不同香型和品質特性的白酒。另外，該酒廠中所產淀粉酶菌株活力相對較低，這也表明了其采用“下沙”時間后移，冬季采暖等措施的科學性。

圖10 菌株2-2的產酶曲線和生長曲線Fig.10 Enzyme production curve and growth curve of strain 2-2

2.5 菌株2-2的產香特性

通過對產香特性分析發現，菌株2-2可以產生乙醇、苯乙醇、正己醇、2-甲基-3-戊醇、4-辛醇、異辛醇、5-甲基-5-壬醇、α-松油醇、糠醇、（2S，3S）-（+）-2,3-丁二醇、香葉醇七種醇類物質，其中苯乙醇、正己醇均為醬香型白酒骨架成分[28]；酮類物質主要有3-羥基-2-丁酮、1-丁醇2-庚酮、2-羥基-3-戊酮和大馬士酮，其中3-羥基-2-丁酮的濃度達到0.35 mg/L，它是合成4-甲基吡嗪的前體物質，而吡嗪類物質是醬香型白酒中的重要風味物質[29]，同時在該菌株的產香實驗中也檢測到了2,5-二甲基吡嗪；此外還可以產生丁酸、異丁酸等有機酸類物質和對乙烯基愈瘡木酚、苯酚兩種酚類物質，對醬香型酒體風味也有較大的貢獻。

3 結論

本研究從北方醬香型白酒大曲中獲得一株產淀粉酶的細菌菌株，通過形態學觀察、生理生化試驗和分子生物學分析綜合鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），該菌株在25～45 ℃和pH 5～9的范圍內都能良好生長，同時還具有12%的乙醇耐受性、15%的NaCl耐受性和70%的葡萄糖耐受性；在37 ℃的條件下培養3 d淀粉酶活力最高，達到18.7 U/mL。綜上可見，該細菌對于北方醬香型白酒釀造具有很好的實際應用意義。