常用肝纖維化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究進(jìn)展

王奎淞，趙鯤鵬，張秋菊

肝纖維化(HF)是慢性肝損傷導(dǎo)致肝內(nèi)膠原纖維異常增生的病理過(guò)程。HF如未得到及時(shí)治療，會(huì)發(fā)展成肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重影響人類健康[1]。HF動(dòng)物模型是HF研究的必要工具，目前其模型制備方法較多，為了方便科研工作選擇HF模型制備方法，本文將目前常用的制備方法做一介紹。

1 化學(xué)損傷HF模型

化學(xué)損傷HF模型是用化學(xué)藥物進(jìn)入肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物造成持續(xù)性肝損傷，誘導(dǎo)形成HF。常用肝毒性化學(xué)試劑有四氯化碳(CCl4)、二甲基亞硝胺(NDMA)和硫代乙酰胺(TAA)。

1.1CCl4誘導(dǎo)的HF模型 四氯化碳(CCl4)是具有微甜氣味，無(wú)色透明易揮發(fā)的脂溶性有機(jī)化合物，可選擇性損害肝細(xì)胞。當(dāng)CCl4隨血液循環(huán)進(jìn)入到肝細(xì)胞后，會(huì)在肝細(xì)胞色素P450作用下，產(chǎn)生一系列自由基使細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等發(fā)生氯烷基化和脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。CCl4造模法由于價(jià)格低廉、可靠性高、可重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)成為了目前使用最多的HF動(dòng)物造模方法。適用于急性、亞急性、慢性肝損傷及肝纖維化、肝硬化的研究，且致病原因和病理表現(xiàn)適合用于反映中醫(yī)濕熱、氣滯以及陰虛的病機(jī)，能為相關(guān)疾病的研究提供適宜動(dòng)物模型[2]。CCl4誘導(dǎo)HF造模法選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多為大小鼠，給藥多采用灌胃和腹腔注射。腹腔注射法造模成功率高，造模周期短，但動(dòng)物死亡率高；灌胃法操作簡(jiǎn)單，動(dòng)物耐受性好，但造模周期長(zhǎng)，造模成功較困難[3]。故目前多選腹腔注射方式造模。

1.1.1單純CCl4誘導(dǎo)的HF模型：CCl4制備HF動(dòng)物模型時(shí)，多選用200 g大鼠以50%CCl4油溶液腹腔注射或灌胃給藥。單次給藥劑量為1 ml/kg，每周2次，給藥總劑量達(dá)1.6 ml時(shí)即可得到穩(wěn)定的HF動(dòng)物模型。一般給藥4周后可觀察到HF樣改變，給藥8周可持續(xù)觀察到穩(wěn)定的HF樣改變[4]。

CCl4制備HF小鼠模型時(shí)多選用25 g小鼠，腹腔注射50%CCl4油溶液，單次給藥劑量2 ml/kg，每周2次，為期6周，給藥總劑量達(dá)0.6 ml時(shí)可得到穩(wěn)定的HF模型；或選用50%CCl4油溶液，單次給藥劑量0.5 ml/kg，每周2次，為期12周，給藥總劑量達(dá)0.3 ml時(shí)可得到穩(wěn)定的HF模型[5]。

1.1.2CCl4聯(lián)合誘導(dǎo)的HF模型：目前CCl4聯(lián)合苯巴比妥或乙醇制備HF動(dòng)物模型已較成熟。苯巴比妥可提高細(xì)胞色素P450活性，增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)CCl4的敏感度，加劇CCl4的毒性作用；乙醇能損傷肝細(xì)胞線粒體，加劇CCl4的肝毒性，促進(jìn)肝損傷，最終形成穩(wěn)定的HF模型[6]。但因CCl4給藥劑量和干預(yù)時(shí)間不易控制，2種聯(lián)合造模法常使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)展為肝硬化甚至產(chǎn)生腹水，導(dǎo)致造模失敗，故現(xiàn)多用于制備肝硬化和肝硬化腹水的動(dòng)物模型[7]。

1.2NDMA誘導(dǎo)的HF模型 NDMA是能同時(shí)溶于水和乙醇的有機(jī)溶劑，可經(jīng)消化道、呼吸道迅速吸收，進(jìn)入體內(nèi)可經(jīng)多途徑誘導(dǎo)肝損傷。此時(shí)，廣泛的全小葉和多小葉壞死能喚醒靜息的肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并開始廣泛合成結(jié)締組織蛋白，從而引起膠原纖維在肝細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致HF[8]。選用NDMA作為HF動(dòng)物模型造模試劑時(shí)，多選擇大鼠，常用0.9%氯化鈉注射液稀釋0.5%NDMA溶液后以2 ml/kg劑量腹腔注射，每周連續(xù)注射3 d，3～4周造模成功[9]。雖NDMA誘導(dǎo)HF模型法穩(wěn)定、成功率高，但因NDMA是有較強(qiáng)肝毒性的致癌物，近年被國(guó)家列為管制藥物，且價(jià)格昂貴，不適合用于HF動(dòng)物模型造模。

1.3TAA誘導(dǎo)的HF模型 TAA是具有肝毒性的有機(jī)化合物，能影響肝細(xì)胞蛋白合成，并于DNA、RNA及蛋白合成酶上產(chǎn)生毒性作用，誘導(dǎo)肝代謝紊亂及血小板降低[10]。TAA誘導(dǎo)的HF動(dòng)物模型在血流動(dòng)力學(xué)、生化指數(shù)改變及形態(tài)學(xué)方面與人類HF表現(xiàn)極相似[11]。用TAA制備HF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型時(shí)，一般選用嚙齒類動(dòng)物，采用灌胃、皮下或腹腔注射方式，將3%TAA溶液按150～200 mg/kg劑量給藥，每周2～3次，造模周期一般>4周[12]。

飲用TAA溶液也可誘導(dǎo)HF形成，且模型持久性與TAA灌胃無(wú)差別[13]，但灌胃法誘導(dǎo)HF周期更短，造模用試劑攝入量更加可控，也不會(huì)出現(xiàn)拒飲情況，杜絕了因飲水量減少造成采血難度加大、飲水量不足導(dǎo)致的死亡；灌胃法還能有效杜絕因多次注射引發(fā)的局部感染，腹腔注射引起的腹腔內(nèi)臟粘連或硬結(jié)形成，且更加接近人類HF形成途徑[14]。

MATSUO等[15]為更加貼近臨床，選用食蟹獼猴作為造模動(dòng)物，將3%TAA溶液按100 mg/kg劑量皮下注射，每周3次，持續(xù)8周造模，給藥4周后可觀察到HF樣改變，給藥8周后可觀察到纖維變性惡化，且通過(guò)組間對(duì)比，認(rèn)為TAA優(yōu)于CCl4，因其既可誘導(dǎo)HF進(jìn)展，又能惡化殘余的肝功能，且只有TAA給藥能使吲哚菁綠清除功能惡化。但因模型動(dòng)物的個(gè)體差異，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(NHPs)對(duì)TAA的反應(yīng)可能比嚙齒類動(dòng)物低得多，故需單獨(dú)修改試劑給藥方案，繼續(xù)探索建立適宜所有NHPs的可用模型制備方案。但此方案只需8周就能建立HF模型，為現(xiàn)有NHPs模型中所需時(shí)間最短的。

2 膳食模型

許多疾病都受到飲食因素的影響，模擬日常生活膳食有助于制備的動(dòng)物模型更加貼近人類疾病的臨床表現(xiàn)。

2.1酒精誘導(dǎo)的HF模型 酗酒已是全球性醫(yī)療保健問(wèn)題，全球超過(guò)5%的疾病是由酗酒引起[16]。肝臟是乙醇代謝的主要場(chǎng)所，乙醇代謝產(chǎn)物乙醛能誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激，使線粒體和微管系統(tǒng)受損，線粒體功能損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和免疫/炎癥反應(yīng)等引起肝損傷，故長(zhǎng)期和(或)短期內(nèi)大量酗酒會(huì)產(chǎn)生廣泛的肝臟病變，使得酒精性肝病(ALD)發(fā)病率升高。

ALD的特征性表現(xiàn)是脂肪變性、肝炎和纖維化/肝硬化。脂肪變性是大量飲酒損傷肝臟后出現(xiàn)的最早征象，特征是脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積。脂肪變性可繼發(fā)為脂肪性肝炎，同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)出現(xiàn)蛋白過(guò)度沉積，甚至可能觀察到過(guò)度的肝臟瘢痕組織形成和血管改變。瘢痕組織可減緩血液通過(guò)肝臟的流速，增加門靜脈壓力及毒素蓄積，導(dǎo)致肝衰竭[17]。

研究表明，由食用白酒替代醫(yī)用乙醇溶液后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物拒飲水現(xiàn)象減少[18]。故可用52°白酒灌服制備小鼠急性酒精性肝損傷模型，劑量12 ml/kg，每日1次，6～12 d可制備成功[19]。孫福榮[20]研究顯示，單次狂飲比長(zhǎng)期規(guī)律適量飲酒更易出現(xiàn)肝臟脂肪變，成為ALD的主要誘因。王秋艷等[21]研究也認(rèn)為短期內(nèi)大量飲酒會(huì)對(duì)肝臟組織造成損傷。故可選用12 ml/kg一次性灌服50%乙醇溶液來(lái)制備小鼠急性酒精性肝損傷模型，16 h便可建模成功。

2.2高脂飲食誘導(dǎo)的HF模型 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)主要包括肝脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[22]。NASH最常見纖維化征象[23]，故可用高脂飲食誘導(dǎo)建立HF模型。雖誘發(fā)NAFLD的機(jī)制及如何發(fā)展為NASH的機(jī)制目前尚未完全闡明，但有學(xué)者認(rèn)為是多因素導(dǎo)致，如胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用率下降，脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)積累，細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡增多，線粒體β氧化能力降低，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激和肝細(xì)胞凋亡[24]。

目前，多使用含約40%脂肪和約0.2%膽固醇固定配比飼料放任模型大鼠隨意飲食或選用高脂日糧，造模周期12周[25]，8～12周得到穩(wěn)定脂肪性HF動(dòng)物模型[26]，在此基礎(chǔ)上添加果糖、游離膽固醇或CCl4能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在表現(xiàn)NAFLD某些特征時(shí)更為明顯和突出[27]。高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性HF模型與人類營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂相關(guān)的非酒精性肝炎致HF的病理過(guò)程最為貼近，該HF模型已較成熟，可為NAFLD相關(guān)疾病的HF樣改變研究提供必要的工具。但因動(dòng)物攝食量、時(shí)間等不易控制，使制備的HF模型個(gè)體差異較大。

2.3蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飲食誘導(dǎo)的HF模型 長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良或攝入不足會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和脂肪變性，續(xù)而可發(fā)展為HF。經(jīng)控制飲食攝入不平衡或缺乏特定營(yíng)養(yǎng)素引起肝細(xì)胞脂肪變性，使肝細(xì)胞對(duì)各種有害因素的抵抗力降低，或使細(xì)胞體積增大彼此擠壓并壓迫肝血竇，逐漸造成肝細(xì)胞凋亡或纖維組織增生，進(jìn)而形成HF。蛋氨酸是構(gòu)成機(jī)體的必需氨基酸，能參與蛋白質(zhì)合成，因不能由動(dòng)物自身生成，故MCD飲食可致HF。MCD會(huì)嚴(yán)重影響肝β氧化、減少極低密度脂蛋白合成，造成肝損傷[28]。MCD模型能很好地復(fù)制人體嚴(yán)重NASH臨床表征，且纖維化進(jìn)展快[29]。

小鼠是MCD制備HF模型的首選，有關(guān)研究使用MCD飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠6周后發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)PAI-1、TGF-β1、α-SMA等促纖維化蛋白和基因水平升高，提示HF形成[30]。胱氨酸、維生素等其他營(yíng)養(yǎng)因素可引起肝細(xì)胞壞死，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化，也可用于制造HF動(dòng)物模型[31]。值得注意的是，MCD造模方案雖會(huì)導(dǎo)致模型動(dòng)物體質(zhì)量下降，但未見血清胰島素、空腹血糖、瘦素和三酰甘油等降低[32]，和人類NASH表現(xiàn)還有一定差異，提示選用此造模方法尚需綜合考慮存活率和病理特征。有研究發(fā)現(xiàn)，MCD誘導(dǎo)的3～5周齡幼鼠已可為兒童NAFLD研究提供合適的動(dòng)物模型[33]。

3 自身免疫性HF模型

自身免疫性肝炎可在免疫或病毒感染等因素影響下誘使免疫細(xì)胞攻擊自身肝細(xì)胞，致肝臟炎癥性壞死，繼而發(fā)展為HF、肝硬化等[34]。目前，該模型制備方法使用動(dòng)物血清作為抗原反復(fù)注射引起肝細(xì)胞損傷或經(jīng)手術(shù)膽總管結(jié)扎法以激活造模動(dòng)物自身免疫反應(yīng)，制備自身免疫性HF模型。

3.1豬血清誘導(dǎo)HF模型 豬血清是自身免疫性HF模型制備中最常用的異種血清，當(dāng)其注入模型動(dòng)物體內(nèi)后，會(huì)刺激產(chǎn)生抗體形成免疫復(fù)合物(IC)激活補(bǔ)體，長(zhǎng)期抗原刺激形成的IC會(huì)沉積于血管壁，引起變態(tài)反應(yīng)造成血管炎和血管周炎，導(dǎo)致肝損傷，形成廣泛的進(jìn)行性慢性炎癥，如此反復(fù)的肝細(xì)胞變性、壞死和增生，逐漸發(fā)展為纖維化樣改變[35]。豬血清多為0.5 ml/只腹腔注射，每周2次，4周見HF指征，8周造模結(jié)束，12周時(shí)發(fā)現(xiàn)造模時(shí)間越久HF表現(xiàn)越明顯[36]。研究顯示，豬血清誘導(dǎo)的HF大鼠模型血液流變學(xué)表現(xiàn)十分符合中醫(yī)“血瘀證”血行不暢和血不循經(jīng)的特點(diǎn)[37]，這無(wú)疑為使用“活血化瘀”法治療HF提供了有力證據(jù)。

3.2膽汁淤積性HF模型 膽汁淤積性肝病可導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、進(jìn)行性纖維化甚至終末期肝病[38]。制造膽汁淤積性HF動(dòng)物模型時(shí)，常使用膽總管結(jié)扎造模法，即選用8～12周雄性小鼠經(jīng)手術(shù)激活其自身免疫反應(yīng)制造HF模型。GARCIA-RUIZ等[39]使用2%異氟烷麻醉小鼠，沿腹中線開腹后鈍性分離膽總管與門靜脈及肝側(cè)壁，于近肝門處雙重結(jié)扎膽總管，并剪斷膽總管確保完全阻斷，生理鹽水沖洗腹膜腔，縫合腹壁并予止痛藥物。術(shù)后12、24 d取肝檢測(cè)，可觀察到丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素升高，蘇木精-伊紅染色、Masson染色和天狼猩紅染色可觀察到壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膽管增生和纖維化樣變。膽總管結(jié)扎造模法操作簡(jiǎn)單，成模率高。但操作過(guò)程中需嚴(yán)格無(wú)菌操作，以避免術(shù)后感染，建議術(shù)中或術(shù)后予抗菌藥物預(yù)防感染；操作人員操作應(yīng)熟練、細(xì)致，以避免人為操作失誤導(dǎo)致的膽汁或腸內(nèi)消化液流入腹腔引發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。

4 小結(jié)

每種HF模型制備方法都存在不同的優(yōu)缺點(diǎn)，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵筮x擇合理的模型制備方法。因個(gè)體差異，模型動(dòng)物對(duì)藥物劑量的敏感度不同，建議首先行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索適宜劑量，切勿盲目模仿他人研究。因動(dòng)物和人類必然存在生物學(xué)差異，動(dòng)物模型永遠(yuǎn)不能完全表現(xiàn)出人類疾病的臨床表現(xiàn)，但能幫助我們不斷接近疾病的根本病因，直至攻克疾病。