控制展青霉素產(chǎn)生菌方法綜述

李 瑞，胡青菊，沈雪維，張東新，殷 勤， 段騰飛

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

我國(guó)每年生產(chǎn)大量的水果、谷物及其制品，除了滿足自身需求，在出口貿(mào)易中也占有很大比例。近年來(lái)，食品中毒事件頻發(fā)，引起了社會(huì)的高度關(guān)注，其中真菌毒素引起食品污染的事件發(fā)生在日常飲食中，時(shí)刻影響著人類的健康。許多國(guó)家對(duì)果品中展青霉素檢出率都有嚴(yán)格的限定。因此，研究如何使果品中展青霉素達(dá)到良好的控制效果具有迫切的現(xiàn)實(shí)意義。

1 展青霉素及其在果蔬行業(yè)的危害

1.1 展青霉素的理化性質(zhì)

展青霉素又名珊瑚青霉毒素、棒曲毒素，是一種普遍存在于食品中的真菌類毒素。化學(xué)名稱為4-羥基4-氫-呋喃，分子式為C7H6O4，分子量為154，呈無(wú)色結(jié)晶，易溶于氯仿、丙酮、水、乙醇及乙酸乙酯，微溶于乙醚和苯，不溶于石油醚。展青霉素是一種多聚乙酰內(nèi)酯，在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，堿性條件中活性降低易被破壞[1-2]。

1.2 展青霉素的毒性

展青霉素是由擴(kuò)展青霉、曲霉等各種真菌產(chǎn)生具有遺傳毒性的次級(jí)代謝物[3]。對(duì)人體和動(dòng)物具有未知的潛在毒性，長(zhǎng)期食用含展青霉素制品會(huì)對(duì)機(jī)體功能造成嚴(yán)重?fù)p害，可能會(huì)引起嘔吐、惡心、便血、抽搐、昏迷等癥狀。世界衛(wèi)生組織對(duì)展青霉素的毒性進(jìn)行檢測(cè)分析并將其列為三類致癌物。通過(guò)大量細(xì)胞毒理學(xué)和動(dòng)物試驗(yàn)，認(rèn)為展青霉素的毒性表現(xiàn)在致癌性、急性毒性、免疫毒性、生育毒性、亞急性毒性、腎毒性、皮膚毒性、遺傳和和細(xì)胞毒性等[4]。

世界衛(wèi)生組織、歐盟和美國(guó)的食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)食品中展青霉素的殘留問(wèn)題給予了高度重視。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規(guī)定食品中展青霉素的含量不得高于10~15LD50/(mg/kg)[5]。盡管國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品中展青霉素的含量進(jìn)行了嚴(yán)格限定，仍然有大量產(chǎn)品難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，如何降低食物中的展青霉素已經(jīng)演變?yōu)楫?dāng)今世界面臨的重要難題之一。

1.3 展青霉素在果蔬行業(yè)的危害

在果蔬生產(chǎn)、加工、包裝、貯存、運(yùn)輸、銷售、食用等過(guò)程中容易受到機(jī)械損傷，果皮受損后很容易被病原菌侵染而產(chǎn)生霉變。常見(jiàn)的寄主包括蘋果、獼猴桃、梨、番茄等水果及其加工制品[6]。

研究表明，即使去除發(fā)霉水果的腐爛部分，周圍新鮮組織中仍含有展青霉素污染的情況。這些水果再經(jīng)過(guò)加工生產(chǎn)，使得果汁、果酒等產(chǎn)品中的展青霉素難以達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。不僅構(gòu)成了極大的安全隱患，也在很大程度上制約了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的出口貿(mào)易，對(duì)果蔬產(chǎn)業(yè)發(fā)展也是巨大的打擊。因此，為了維護(hù)公眾健康和食品安全，需要在確保安全的前提下，盡可能對(duì)食品中的展青霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行預(yù)防和控制。

2 展青霉素的檢測(cè)方法

由于展青霉素能夠帶來(lái)多種復(fù)雜的潛在毒性，因此各國(guó)學(xué)者一直致力于研發(fā)能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)展青霉素的方法。雖然目前針對(duì)展青霉素的測(cè)定方法有多種，但各有缺陷。薄層色譜法操作繁瑣，液相色譜設(shè)備昂貴，對(duì)樣品純度要求高，氣相色譜前處理繁雜，酶免疫吸附不成熟。

我國(guó)研究人員一直致力于尋找可以快速有效測(cè)定水果中展青霉素的方法。2020年出版的《中國(guó)藥典》對(duì)2 351種真菌毒素的測(cè)定方法進(jìn)行了修訂，特別提出了使用液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用色譜法、多種真菌毒素液質(zhì)聯(lián)用法和黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫法（黃曲霉素ELISA）[7]檢測(cè)展青霉素。

2.1 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）最早被用于蘋果制品中展青霉素含量的測(cè)定。該方法設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉，但在樣品預(yù)處理操作時(shí)較繁雜費(fèi)時(shí)，需要經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑萃取、碳酸鈉凈化、真空減壓濃縮、薄層展開等定量分析步驟，雜質(zhì)干擾較嚴(yán)重，難以避免假陽(yáng)性，有時(shí)分離效果不好，只能半定量[8]，并且不能檢測(cè)出果品中殘留的展青霉素。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）較于薄層色譜法而言，效率更高、靈敏度更大、適用范圍更廣、分析速度更快[9]。但價(jià)格昂貴，需使用各種填料粒和大量的流動(dòng)相，并且容量小、大多具有毒性。李先江等人[10]采用液相色譜法對(duì)乙腈中展青霉素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性、短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)。

2.3 色譜聯(lián)用技術(shù)

色譜聯(lián)用技術(shù)主要分為液-質(zhì)聯(lián)用色譜法（LC/MS）和氣-質(zhì)聯(lián)用色譜法（GC/MS）。GC/MS能夠高效分離待測(cè)物質(zhì)，需要衍生介質(zhì)、衍生促進(jìn)劑、內(nèi)標(biāo)進(jìn)行分析前衍生化，前期浸提處理費(fèi)時(shí)、繁瑣[11]。LC/MS在檢測(cè)展青霉素前需要經(jīng)過(guò)溶劑萃取和提取液凈化，然后進(jìn)行色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)。液-質(zhì)聯(lián)用色譜法可以滿足快速篩查和精確定性定量的要求[12]。質(zhì)譜與色譜的結(jié)合可以充分利用兩者的優(yōu)勢(shì)[13]。

2.4 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有成本低、便捷、高效、快速等特點(diǎn)。其原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合，再使用諸如同位素、熒光素或酶之類的標(biāo)記技術(shù)來(lái)定性或定量的顯示待測(cè)物質(zhì)[14]。目前，除了Mcelroy L J等人[15]利用多克隆抗體建立的酶聯(lián)免疫法廣泛運(yùn)用以外，還開發(fā)出了放射免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫傳感器等多種準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)技術(shù)[16]。

3 展青霉素的防治控制方法

3.1 脫毒方法

3.1.1 物理脫毒

物理脫毒的方法有輻射、加熱、吸附等。紫外照射、電磁輻射的方法能夠在不同程度上減少展青霉素的含量，微波處理、稀釋法和加熱法等也能夠達(dá)到降解效果。另外，活性炭、硅膠、樹脂等具有吸附作用物質(zhì)可以在液態(tài)環(huán)境中控制展青霉素的含量。但是，物理脫毒的局限性在于成本高和操作過(guò)程繁瑣，目前仍停留在試驗(yàn)階段，尚未投入實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中。

3.1.2 化學(xué)脫毒

化學(xué)脫毒的方法有加二硫化物法、加鹽法、加酸法、加堿法等。加二硫化物法已用于造酒、飲料、果干及濕法碾谷的生產(chǎn)脫毒，作用機(jī)理是二硫化物能夠與展青霉素發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生具有生物活性的化合物，從而達(dá)到脫毒效果[17]。另外，臭氧對(duì)展青霉素也有氧化降解脫毒功能。有研究發(fā)現(xiàn)，植物活性提取物能夠去除展青霉素或者降低其毒性，從而進(jìn)一步提高果蔬的貯藏效果[18]。

3.1.3 生物脫毒

生物脫毒的主要原理是菌株通過(guò)吸附作用來(lái)達(dá)到降低展青霉素的目的。代表性菌株包括氧化葡萄糖桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌和多種酵母菌[19]。此外，酶也能作為生物解毒劑，具有代表性的豬胰脂肪酶就具有成本低、高效、環(huán)保的特點(diǎn)，是使用較廣泛的生物脫毒方法之一。

3.2 抑菌方法

3.2.1 物理抑菌

通過(guò)紫外照射、低溫或者熱激等物理手段可以抑制果實(shí)表面展青霉素產(chǎn)生菌的活性。

巴氏殺菌能夠破壞展青霉素產(chǎn)生菌的孢子，低溫能降低果實(shí)中乙烯的釋放量并減弱病原菌生長(zhǎng)繁殖能力，氣調(diào)貯藏是通過(guò)人工調(diào)改O2和CO2的比例來(lái)達(dá)到防腐保鮮的目的[20]。該方法操作簡(jiǎn)單、效果良好，但在抑菌的同時(shí)會(huì)影響果蔬的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3.2.2 化學(xué)抑菌

通過(guò)利用殺菌劑（如噻菌靈、咪酰胺、克菌丹、抑霉唑等）、防腐劑、酚類抗氧化劑、食品添加劑等[21]來(lái)達(dá)到抑菌作用。但長(zhǎng)期濫用化學(xué)殺菌劑易使展青霉素產(chǎn)生菌有耐藥性，甚至?xí)龠M(jìn)病菌生長(zhǎng)，造成嚴(yán)重的安全隱患和農(nóng)藥殘留問(wèn)題。

3.2.3 生物抑菌

（1）酵母菌。相比物理抑菌和化學(xué)抑菌，利用微生物抑菌更加安全、環(huán)保。采用酵母菌抑制擴(kuò)展青霉的原理主要可以分為2個(gè)方向：①直接作用：進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)，并且分泌胞外水解酶產(chǎn)生抑制作用；②間接作用：提高水果抗性相關(guān)酶的活性，來(lái)誘導(dǎo)組織產(chǎn)生抗性[22]。

（2）芽孢桿菌。芽孢桿菌通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、分泌脂肽類抗生素及誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗性來(lái)抑制病菌產(chǎn)毒，具有高效、安全、綠色環(huán)保的特點(diǎn)[23]。其中，枯草芽孢桿菌分布廣、抗逆性強(qiáng)、繁殖快并且能產(chǎn)生大量的代謝物。這種低成本的處理可以在不破壞果蔬品質(zhì)的前提下達(dá)到高效的抑菌效果。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著國(guó)民收入的不斷增加，人們關(guān)注的焦點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移至食品安全上來(lái)。當(dāng)大量不達(dá)標(biāo)的食品流入市場(chǎng)，使人們被動(dòng)陷入展青霉素的威脅之中。

目前，雖已經(jīng)研制出多種天然保鮮專利產(chǎn)品，但仍存在諸多問(wèn)題，每一種都無(wú)法從根源上徹底消除展青霉素。研究開發(fā)安全、環(huán)保的天然生物防控機(jī)制不僅關(guān)系到我國(guó)水果產(chǎn)業(yè)能否持續(xù)、高速地發(fā)展，更時(shí)刻影響著人們的健康。因此，如何安全有效地抑制展青霉素產(chǎn)生菌成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。