腸道菌群介導飲食對于肥胖表型的作用

管慧慧 劉成林 蒲彥霓 戴宇翔 宗 耕 鄭 琰△

（1復旦大學生命科學學院人類表型組研究院 上海 200438；2復旦大學附屬中山醫院心血管內科 上海 200032；3上海市心血管病研究所 上海 200032；4中國科學院上海營養與健康研究所營養代謝與食品安全重點實驗室 上海 200031）

肥胖作為一種全球流行病[1］，會增加多種慢性疾病風險[2］，降低預期壽命[3］，帶來嚴重的個人和社會經濟負擔[4］。目前，大多數流行病學研究都將體重指數（body mass index，BMI）作為衡量肥胖的指標，但BMI 無法區分瘦質量（去除脂肪后質量）和脂肪質量[5］。同時，身體不同區域的脂肪分布能夠獨立于BMI 對健康造成影響[6］。研究表明，Gynoid 區域[7］、Android 區 域[7］及Android 與Gynoid 區域脂肪含量之比（Android-to-Gynoid fat ratio，AGR）均是與健康和疾病有關的、用于表征肥胖表型的重要指標[8-10］（圖1）。AGR 是中國肥胖兒童和青少年心臟代謝（特別是糖代謝）危險因素的強效獨立預測因子之一[11］，其與胰島素抵抗、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的濃度升高密切相關[9，11］。雙能X 射線吸收法（dual-energy X-ray absorptiometry，DXA）是一種利用身體不同組織（如瘦質量、脂肪質量等）對X 光吸收率不同的原理來測量體內脂肪含量的方法，具有較高的準確性和敏銳度[12］。

圖1 Android 和Gynoid 的脂肪區域Fig 1 Fat areas in Android and Gynoid region

肥胖是一種由多種因素引起的慢性代謝性疾病，與遺傳因素、不良的飲食習慣和生活方式（如久坐不動、缺乏運動、睡眠不足等）、心理因素（如壓力和情緒等）、藥物服用以及社會環境的改變等有關[13］。其中，飲食攝入是導致肥胖和治療肥胖的重要環境因素[14］。Meta 分析發現：攝入紅肉和加工肉類與肥胖風險增加以及較高的BMI 直接相關[15］，減少含糖飲料的攝入量將降低肥胖癥及其相關疾病的患病率[16］。越來越多的證據表明，腸道微生物在代謝中的作用能夠影響肥胖等代謝性疾病的發生[17］。腸道微生物群很可能是飲食影響人類健康和疾病的中介因素。目前關于由飲食誘導的腸道菌群變化及與其臨床結局（如肥胖）相關的研究非常有限，且大多集中在特定膳食的研究。Dong 等[18］發現，高蛋白低能量的減重膳食可改變肥胖人群中的腸道微生物結構。目前尚缺乏來自于整體飲食結構、腸道微生物及肥胖表型的整合人群研究。基于以上背景，本研究旨在對飲食結構和肥胖之間相關聯的腸道微生物因素作初步的探索。

資料和方法

研究對象本研究納入來自復旦大學自我報告健康的8 名研究生志愿者（6 男2 女，年齡22～28歲）。入組標準：（1）在糞便采集前2 周內未用過抗生素類藥物或益生菌；（2）無腹瀉、腸炎、腸癌等腸道相關疾病；（3）無盆腔放療、化療史。 志愿者從S01～S08 隨機編號。本研究通過復旦大學生命科學學院倫理委員會倫理審查（批件號：BE1828）。所有志愿者均簽署知情同意書。

糞便樣本采集、DNA提取及宏基因組文庫制備糞便樣本采集于2019年8月，使用未添加任何保存液的5 mL 糞便樣本采集管（中國朗斌生物試劑耗材有限公司）采集8 名志愿者經勻質化的新鮮糞便，所有樣本均在采集后30 min 內置于-80 ℃冰箱冷凍保存。使用TIANamp Stool DNA 試劑盒[中國天根生化科技（北京）有限公司］，根據說明書提取糞便樣本總DNA。DNA 濃度通過EqualbitTM dsDNA HS 分析試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）在Invitrogen Qubit3.0（美國賽默飛公司）上進行熒光定量。使用Tn5 轉座酶DNA 文庫構建試劑盒（美國APExBIO 公司），投入1 ng DNA 構建Illumina測序文庫，用Agilent 生物分析儀2200（美國安捷倫公司）確定每個文庫的插入片段大小和濃度。

全基因組鳥槍法測序和數據處理委托南京諾禾致源生物信息科技有限公司采用Illumina Novaseq6000 平臺對糞便微生物宏基因組文庫進行鳥槍法測序。在此過程中，使用FastQC 軟件（版本號0.11.8）對原始下機數據進行質量檢測；使用過濾軟件Trimmomatic（版本號0.33），切除接頭序列、引物序列以及低質量的堿基；采用Bowtie2（版本號2.3.4.3）將質控后的數據與人類參考基因組進行比對，進一步剔除污染序列；獲得質控數據之后，使用MetaPhlAn 3.0 軟件，先從全基因組數據庫中找出物種特異性標記基因，再利用這些標志基因的數據庫對高通量測序得到的鳥槍序列進行注釋[19］，獲得微生物群落的組成，并在種水平計算各細菌相對豐度。α-多樣性分析中，使用Shannon 指數和Simpson指數衡量樣品內微生物豐富度和均一度。β-多樣性分析中，使用Bray-Curtis 矩陣法對樣品間群落結構差異進行計算。

3天24h 飲食回顧數據收集為了評估志愿者平均每日的谷類、蔬菜、水果、畜禽肉類、奶及奶制品、豆及豆制品、魚蝦貝類、甜點和飲料等飲食組分的攝入情況，在糞便樣本采集的前3 天（包含2 個工作日和1 個周末），經過培訓的調查員采用開放式調查表，每天面對面詢問志愿者前1 天（從調查日午夜到前一日午夜）攝入的所有食物和飲料。使用汪之頊等[20］編撰的《回顧性飲食調查輔助參照食物圖譜》估計每種食物的攝入量。

肥胖表型數據采集肥胖表型數據采集所用DXA 測量儀為美國GE Lunar Prodigy（美國GE Healthcare 公司）掃描儀，分析軟件為13.31 版。在DXA 掃描期間，志愿者被要求身體筆直平躺并處于靜止狀態直到掃描結束。DXA 掃描后，7 種與肥胖相關的身體脂肪表型（即肥胖表型）被納入研究，包括軀干脂肪含量（簡稱Trunk）、Android 區域脂肪含量（簡稱Android）、Gynoid 區域脂肪含 量（簡稱Gynoid）、AGR、全身脂肪含量（簡稱TBF）、BMI、腰臀比（waist-to-hip ratio，WHR）。Trunk、Android 和Gynoid 以該區域脂肪質量占該區域脂肪、肌肉、骨礦鹽含量三者總質量的百分比表示，而全身脂肪含量以全身脂肪質量占總體重的百分比表示。肥胖表型采集過程中，要求受試者脫掉鞋子，使用測深儀測量受試者的身高；使用數字刻度測量受試者的體重；BMI 以體重（kg）除以身高（m）的平方表示。使用軟尺在呼氣末、吸氣未開始時測量經臍部中心的水平圍長，即腰圍；使用軟尺在呼氣末、吸氣未開始時測量臀部最寬處，即臀圍；WHR 為腰圍與臀圍的比率。

統計學分析基于樣本間的Jensen-Shannon 距離，利用圍繞中心點劃分算法（partitioning around medoid，PAM）[21］，把腸道微生物屬水平在高維數據空間中客觀存在的聚集效應（即腸型）呈現出來，最佳分類數目通過Calinski-Harabasz（CH）指數確定[22］，腸型的可視化通過使用R 軟件的ade4 包的類間分析（between-class analysis，BCA）構建圖形來實現[23］。在對飲食結構和腸道微生物做關聯性分析時，使用Bray-Curtis 距離估算微生物距離矩陣，使用Euclidean 距離估算3 天24 h 飲食結構數據距離矩陣，使用普氏分析探索飲食結構和腸道微生物之間的關聯。使用雙側t檢驗分析不同腸型之間飲食組分是否存在統計學差異。使用Wilcoxon 秩和檢驗分析性別對腸道微生物的構成是否存在統計學差異，以及肥胖表型高、低兩組志愿者之間糞便微生物的α-多樣性和β-多樣性是否存在統計學差異，使用錯誤發現率（false discovery rate，FDR）對P值進行校正。使用線性回歸分析計算相對豐度前20的菌屬或菌種與肥胖表型之間的關聯程度時，校正了協變量年齡和性別，且對菌群和肥胖表型數據分別進行歸一化處理。以P＜0.05 為差異有統計學意義，以P＜0.01 為差異有顯著統計學意義。使用R包（4.1.1 版）vegan[24］、ade4[23］、ggplot2、pheatmap 對數據進行分析和可視化。

結果

志愿者的菌群結構特征在我們的志愿者中，腸道微生物主要來自兩個屬。志愿者S01 和S05 的腸道菌群主要由普氏菌屬（Prevotella）組成，其中普氏菌屬在S01 的腸道菌群中比例高達56.0%，在S05中比例為41.9%；在其他志愿者中擬桿菌屬（Bacteroides）的相對豐度最高（圖2A）。在相對豐度前10 的菌種中，S01 和S05 以普氏菌屬中的人體普氏菌（Prevotella copri）相對豐度為最高，分別為56.0% 和42.0%；S03（15.8%）、S06（17.0%）和S08（25.3%）的腸道菌群中都含有一定比例普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）；S02 和S04中單形擬桿菌（Bacteroides uniformis）占比較高，分別為19.4% 和27.4%；S04（10.4%）和S06（20.0%）中多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）占比較高（圖2B）。菌群屬水平的分型結果表明，優勢菌群結構相似的樣本分別聚成兩個簇，以腸道內的細菌種類和數量劃分，8 個志愿者分成了以擬桿菌屬和普氏菌屬為優勢菌屬的2 種腸型：擬桿菌型和普氏菌型（圖3）。Wilcoxon 秩和檢驗顯示不同性別的志愿者在腸道菌群的α-多樣性（Shannon index：P=0.64；Simpson index：P=0.64）和基于Bray-Curtis 距離計算的β-多樣性第一主成分（the first principal component analysis，PCoA1）（Bray-Curtis PCoA1：P=0.86）上差異無統計學意義。

圖2 8 名志愿者中相對豐度前10 的菌屬（A）和菌種（B）的堆積柱狀分布圖Fig 2 Stacked columnar distribution of the top 10 genera（A）and species（B）in relative abundances from 8 subjects

圖3 不同腸型志愿者之間的系統發育差異Fig 3 Phylogenetic difference among the subjects of different enterotypes

腸道微生物與飲食結構的關聯食物相似性聚類結果顯示，8 個志愿者的飲食結構不同（圖4A）。 基于飲食結構的主成分分析（principal components analysis，PCoA）能夠將志愿者飲食結構差異可視化，其中S01 和S05 的飲食結構第一主坐標距離近，S03、S04、S06 和S07 的第一主坐標距離近，飲食結構分型與腸型聚類有吻合之處（圖4B）。我們用Euclidean 距離計算3 天24 h 飲食回顧的膳食攝入量β-多樣性，用Bray-Curtis 距離計算微生物（種水平β-多樣性），普氏分析的平均飲食和平均微生物群距離之間具有顯著的一致性（P=0.01，圖5）。雙側t檢驗結果顯示兩種腸型志愿者之間的十字花科蔬菜（P=0.032）、豆類及豆制品（P=0.015）、精加工谷物（P=0.008）和全谷物（P=0.048）攝入量差異有統計學意義。普氏菌型志愿者十字花科蔬菜、精加工谷物和全谷物的食用量約是擬桿菌型志愿者的2 倍，而豆類及豆制品的食用量則遠低于擬桿菌型志愿者；擬桿菌型志愿者魚和其他海鮮類產品、動物內臟、紅肉的食用量高于普氏菌型志愿者（表1）。

表1 兩種腸型志愿者主要的飲食組分差異分析Tab 1 Difference analysis of diet composition between the subjects of two enterotypes

圖4 志愿者3 天24 h 飲食回顧數據的飲食結構分析Fig 4 Analysis of dietary structure based on 3‐day，24‐hour diet recall data from the subjects

圖5 志愿者飲食結構與腸道菌群普氏分析Fig 5 Procrustes analysis between dietary structure and gut microbiome from the subjects

腸道微生物與肥胖表型的關系根據每個肥胖表型（BMI、Trunk、Android、Gynoid、AGR、TBF及WHR）分別對志愿者進行分組（表2），低于中位值視為低肥胖表型組，高于中位值視為高肥胖表型組，分析兩組之間α-多樣性和β-多樣性的區別。結果提示，體脂含量低的志愿者可能擁有更高的菌群物種豐富度（Shannon 指數）與更低的物種均勻度（Simpson 指數），但差異無統計學意義（圖6A、6B）。Trunk、Android、Gynoid 和TBF 這4 個肥胖表型與β-多樣性具有相關性（P＜0.05，圖6C）。 就Android、Gynoid、TBF 和Trunk 這4 個肥胖表型而言，在體脂較高和體脂較低的兩組人中，腸道微生物物種組成差異明顯。肥胖表型與相對豐度前20 的菌屬之間的線性回歸分析顯示：BMI、WHR 分別與副桿菌屬（Parabacteroides）和薩特氏菌屬（Sutterella）呈正相關（圖7A）；擬桿菌屬與Trunk、Android 以及TBF 呈顯著正相關（ 圖7A）；而普氏菌屬 與Trunk、Android、Gynoid 及TBF 呈顯著負相關（圖7A）；小桿菌屬（Dialister）與Gynoid 呈負相關（圖7A）。當使用相對豐度前20 的菌種進行回歸分析時時，BMI、WHR分別與多形擬桿菌、狄氏副擬桿菌（Parabacteroides distasonis）以及挑剔真桿菌（Eubacterium eligens）呈正相關（圖7B）；普通擬桿菌與Trunk、Gynoid及TBF 呈顯著正相關（圖7B）；而人體普氏菌與Trunk、Android、Gynoid 及TBF 這4 種肥胖表型呈顯著負相關（圖7B）；Gynoid 與Dialister succinatiphilus呈負相關（圖7B）。

圖6 肥胖表型高、低組志愿者之間糞便微生物的α‐多樣性和β‐多樣性Fig 6 α‐ and β‐diversity of the fecal microbiome in subjects with high and low adiposity phenotype

圖7 腸道微生物相對豐度排名前20 的屬（A）和種（B）與肥胖表型及微生物多樣性的關聯Fig 7 Relationship between the top 20 genera（A）and species（B）in the relative abundance of gut microbes with adiposity phenotype and microbial diversity

表2 8 位志愿者的肥胖表型的基本特征（2 女，6 男）Tab 2 Basic characteristic of adiposity phenotypes from 8 subjects（2 females and 6 males）

討論

腸型的研究最早于2011年提出，當時的研究（n=39）根據腸道內的細菌種類和數量劃分出三種腸型：擬桿菌型、普氏菌型和瘤胃球菌型，分別反映了各腸道生態系統中的優勢菌[25］。隨后，Wu 等[22］研究發現，糞便微生物群落聚集成的腸型，主要以

擬桿菌和普氏菌的水平來區分，腸型與長期飲食密切相關，尤其是蛋白質、動物脂肪、碳水化合物。2017年，29 位腸道菌群研究專家對腸型這一備受爭議的概念做了充分探究[26］，考慮到準確量化腸道群落結構的挑戰，腸道穩定狀態的確切定義難以確定。盡管如此，在許多研究（主要為西方）中，擬桿菌屬和普氏菌屬都是個體間最主要的差異類群，并能夠解釋菌群最主要的變異[26］。本研究根據腸道內的細菌種類和數量把志愿者分成兩種腸型：擬桿菌型和普氏菌型，與既往報道相一致。本研究尚處于初步探索階段，需要在大樣本人群中進一步驗證。既往研究表明，擬桿菌型人群擅長消化各類食物；普氏菌型人群對脂類代謝較弱。腸型和血型一樣，與年齡、性別、國籍、體重指數等特征無關，但受到長期飲食習慣的影響[25］。

我們在做飲食結構與腸道菌群的普氏分析時發現，飲食結構與腸道微生物群落結構之間顯著相關，而且普氏菌型志愿者攝入十字花科蔬菜和谷物的量遠高于擬桿菌屬志愿者。

該研究確定了腸道菌群改變、循環氨基酸和肥胖癥之間的未知聯系，為靶向腸道菌群進行肥胖癥干預提供了思路。在益生元干預評估超重和肥胖兒童腸道微生物組成和糞便膽汁酸變化總量的隨機對照研究中，給予富含低聚果糖的菊粉對照組在干預16 周后，體重評分明顯下降，腸道微生物群中雙歧桿菌增加，普通擬桿菌則顯著減少，軀干脂肪的變化與普通擬桿菌的變化呈顯著正相關[27-28］，本研究結果與文獻報道一致。Vadder[29］研究發現，人體普氏菌通過與膳食纖維發酵過程中產生琥珀酸酯的機制改善了葡萄糖代謝和胰島素敏感性，發現富含可發酵膳食纖維飲食與高琥珀酸酯的產生有關。就肥胖表型相關基因或通路而言，Guo 等[30］研究發現，在中國成年人群中，脂肪酸相關的基因多態性與脂肪分布和代謝危險因素有關，并且相關性存在性別差異。腸道微生物主要通過菌群代謝產物和衍生物調控人類宿主表型，它們作為菌群的“信使”，影響宿主能量穩態，調控宿主代謝，從而影響肥胖表型的產生和變化。例如，在膽汁酸通路上，腸道微生物將初級膽汁酸轉換成為次級膽汁酸，后者具有促進能量代謝、增加胰島素敏感性、減輕炎癥的作用；在短鏈脂肪酸通路上，腸道微生物作用于膳食纖維，生成短鏈脂肪酸，為腸道微生物提供能量來源，同時可刺激飽腹感激素的產生[31］。

本研究發現飲食和腸道微生物之間具有相關性，進一步發現不同腸型之間飲食組分的差異：普氏菌型志愿者比擬桿菌型志愿者食用更多的十字花科蔬菜和谷物。腸道微生物和肥胖表型之間的關系顯示，普氏菌屬與Trunk、Android、Gynoid 和TBF 呈負相關，擬桿菌屬與Trunk、Android 和TBF呈正相關。根據飲食與腸道菌群的相關性以及腸道菌群與肥胖表型的相關性，我們做出合理推測：腸道菌群可能介導飲食對于肥胖表型的作用。影響腸道微生物構成的因素很多，本研究主要探討了飲食和性別的影響，雖然控制了年齡、地理位置、藥物使用以及胃腸道疾病這些變量，但在研究設計中沒有考慮到志愿者的運動情況。由于樣本量相對較小，缺乏深入的生物和生化信息，無法解釋飲食、微生物、宿主和其他潛在因素之間的復雜生理聯系。本研究表明腸道微生物群的改變是肥胖表型改變的標志，可能介導飲食對于肥胖的作用。未來的研究應當就影響腸道菌群介導飲食作用于肥胖的混雜因素（如運動情況、年齡、地理位置等），針對不同特征的大樣本人群（如老人、兒童或疾病患者）進行研究，進而結合個體差異性來認知腸道微生物群與健康人群之間的流行病學關聯。

作者貢獻聲明管慧慧，劉成林 論文構思、撰寫和修訂，數據采集和統計分析，制圖。蒲彥霓飲食結構數據分析，制圖，論文修訂。戴宇翔 論文指導和修訂。 宗耕 項目構建，論文修訂。 鄭琰 論文構思、指導和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。