尿源性干細胞外泌體對高糖誘導內皮細胞損傷的保護作用

莊靖銘 高 鵬 尹 爍 吳復躍 侯劍剛△

（1復旦大學附屬華山醫院泌尿外科 上海 200040；2上海睿泰再生醫學臨床應用研究院 上海 200040）

糖尿病是一種發病率很高的嚴重的代謝疾病，影響全球超過3 億人，預計2023年的患病人數將達到5.92 億[1］。它是由復雜病因引起的以高血糖為特征的代謝綜合征[2］。 2 型糖尿病占糖尿病的90%，其發病率和死亡率遠遠高于1 型糖尿病。心臟、腦、腎臟和視網膜的血管并發癥是2 型糖尿病最常見的慢性并發癥。且患者血管疾病預后與其能否維持正常血糖水平之間存在明顯關聯[3］。與血管平滑肌細胞不同，內皮細胞不能調節內在葡萄糖水平，可能導致葡萄糖及其衍生物的積累，引起代謝紊亂。因此內皮功能障礙是高血糖的直接結果，也是2 型糖尿病血管并發癥的關鍵步驟[4］。本課題組在研究男性勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）時發現，與一般人群相比，糖尿病患者的ED 發病較早，患病率較高，是非糖尿病患者的3 倍，綜合患病率＞35%，且年齡越大，嚴重程度越高[5］。盡管發病率很高，但與其他糖尿病并發癥相比，它往往被忽視。從機制上講，性沖動信號通過副交感神經傳遞，引起內皮和神經末梢釋放一氧化氮（nitric oxide，NO），推動陰莖海綿體平滑肌松弛，海綿體血流量增多，從而導致勃起。糖尿病患者體內長期高糖環境對海綿體內皮細胞有較大的損傷作用，NO 產量急劇減少，出現勃起障礙[6］。因此，內皮細胞是防止ED 在內多種糖尿病血管并發癥的潛在靶標，也是我們研究的重點。

尿源性干細胞（urine-derived stem cells，USCs）是從尿液中分離出來的細胞亞群，與間充質干細胞具有類似的表面標記物，包括CD44、CD73、CD90 和CD105等。這些細胞具有干細胞的生物學特性，并且能夠在特殊的誘導培養中分化為骨骼、肌肉和脂肪等多種細胞[7］。與其他類型的干細胞相比，USC 的使用具有可連續性，用非侵入性、簡單且低成本的方法即可獲得[8］。已有研究報道，USC 來源的外泌體（USC-Exo）可預防糖尿病性腎病，改善糖尿病性ED[8-9］，還可以在后肢缺血中促進血管生成和肌肉再生[10］。國內外學者普遍使用人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）體外研究人內皮細胞功能。本課題組于新鮮臍帶中提取HUVEC，并將其暴露于高濃度葡萄糖環境中，以模擬糖尿病患者體內的內皮損傷，多方面驗證USC-Exo在內皮細胞損傷過程中的作用。

材料和方法

主要材料本研究經復旦大學附屬華山醫院倫理委員會批準[2021 臨審第（009）號］。臍帶取自當日剖宮產健康嬰兒的新鮮臍帶（來源于復旦大學附屬華山醫院北院婦產科），產婦及家屬對于實驗研究均知情同意，并簽署知情同意書。尿液由3 名平均年齡為25歲的男性志愿者提供。其他材料包括：EGM-2 培養基、REGM 培養基（瑞士LONZA 公司）；PBS、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（美國GIBCO 公司）；Ⅰ型膠原酶（美國Sigma 公司）；鼠抗 人CD29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD133、CD146、HLA-DR 多克隆流式抗體（美國Biolegend 公司）；鼠抗人vWF 單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；山羊抗鼠二抗AF488（美國Thermo Fisher 公司）；含DAPI 抗熒光淬滅封片液（上海碧云天生物技術有限公司）；超濾管（美國Millipore 公司）；cell counting kit-8 試劑盒（CCK-8；日本同仁公司）；Matrigel 基質膠（美國Corning 公司）；紅色熒光標記的人源乙酰化低密度脂蛋白[human DiI-acetylated low density lipoprotein，Human DiIAc-LDL；翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；TRIzol試劑（美國Thermo Fisher公司）。

細胞培養HUVEC 的分離和培養過程參照文獻[11］。取符合要求的臍帶，剖腹產4 h 內運送至實驗室進行操作，全程保證無菌。使用1×PBS 從一端沖洗臍靜脈，直到另一端流出的緩沖液透明或略帶粉紅色以確保無紅細胞。用止血鉗夾閉臍靜脈一端，從另一端注射0.2% 的Ⅰ型膠原酶溶液，灌滿后立即止血鉗夾閉。放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱消化10 min。取出并打開止血鉗，用40 mL 1×PBS 沖洗靜脈，收集細胞，加入5 mL FBS 終止消化。收集細胞于50 mL 離心管中，室溫750×g離心10 min 棄上清，加EGM-2 培養基重懸細胞沉淀于6孔板中培養。培養環境為37℃、5% CO2細胞培養箱，每2 天換液一次。USC 的分離和培養過程參考文獻[12］。每次至少收集志愿者中段尿200 mL，分裝后室溫400×g離心10 min。棄上清，保留1～2 mL液體。收集各管沉淀，加入PBS 定容至40 mL。再次以相同條件離心10 min，保留約300 μL 沉淀，使用12 mL REGM 培養基重懸細胞。接種至明膠預先包被30 min 的6 孔板。培養環境為37 ℃、5% CO2細胞培養箱，每2.5 天換液一次。

流式鑒定細胞表面標記物取第3 代HUVEC和USC，0.25% 胰蛋白酶消化后制成細胞懸液。400×g離心5 min，PBS 清洗后計數。調整細胞量為5×106/管，以100 μL PBS 溶解，并加入流式細胞抗體，混勻后室溫避光孵育30 min。PBS 清洗2 遍后使用300 μL PBS 溶解上機檢測分析。

免疫熒光鑒定胞內標記物將第3 代HUVEC鋪于96 孔板，PBS 清洗3 次后用4% 多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗。使用0.5% Triton X-100 室溫破膜20 min，PBS 清洗后正常山羊血清室溫封閉30 min。加入5% BSA-PBS 配制的一抗4 ℃孵育過夜。第2 天PBS 清洗后加入熒光標記的二抗室溫避光孵育1 h。PBS 清洗3 次后加入適量抗熒光淬滅封片液（含DAPI）孵育10 min。置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

USC‐Exo 分離純化與鑒定取處于對數生長期的第2～5 代USC，細胞生長匯合至80%～90% 后，用去除外泌體的FBS 配置完全培養基培養48 h，收集上清液。在4 ℃下以2500×g離心20 min，棄沉淀。使用0.22 μm 滅菌過濾器過濾，以去除殘留的細胞和細胞碎片。 將上清液轉移到超濾管中，在4 ℃下以100000×g離心70 min，棄上清液。 用PBS 重懸沉淀USC-Exo，于-80 ℃保存備用。

透射電子顯微鏡觀察USC‐Exo 形態將USCExo 固定于2.5% 戊二醛-多聚甲醛混合固定液中，取10 μL 滴于透射電鏡專用覆膜銅網上，靜置2 min后用濾紙吸去液體。 滴加2% 醋酸雙氧鈾染色5 min，去除液體，晾干。置于透射電子顯微鏡觀察。USC-Exo 粒徑分布分析：納米顆粒跟蹤分析系統QNano 平臺檢測USC-Exo 顆粒直徑與密度。

增殖實驗每孔取相同起始量的HUVEC（密度為3×103/孔）鋪于96 孔板，培養液為100 μL，在37 ℃、5% CO2的環境下培養2 h 后細胞貼壁。細胞貼壁后棄去初始培養基，換為各組對應的培養基進行培養。根據參考文獻[13］以及我們前期篩選實驗的結果，將細胞分為6 組培養：正常濃度葡萄糖（5.5 mmol/L）、正常濃度葡萄糖+USC-Exo（1×108、1×109particles/mL）、高濃度葡萄糖（33 mmol/L）和高濃度葡萄糖+ USC-Exo（1×108、1×109particles/mL）。每組5 個孔，于37 ℃、5% CO2的環境下培養48 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液孵育2 h 后，使用多功能酶標儀測定各孔450 nm 波長下的吸光度。

劃痕遷移實驗為了研究USC-Exo 對HUVEC在高葡萄糖濃度下細胞遷移的作用，參考文獻進行了體外劃痕實驗[14］。將1×105個細胞接種至24 孔板，等待細胞貼壁24 h。按各組條件處理48 h 后，使用無菌的200 μL 移液槍頭尖端由上至下刮去細胞單層，并用PBS 洗滌以除去細胞碎片。在刮擦后0、4、6 h 使用倒置光學顯微鏡進行拍攝。 并使用Image J 軟件分析遷移面積。遷移速率計算如下：遷移區域（%）=（A0-AT）/A0×100%，其中A0表示初始傷口的面積，AT表示在該時間點傷口的剩余面積。

成管實驗用正常濃度葡萄糖、高濃度葡萄糖和USC-Exo 在6 孔板中進行分組預處理HUVEC 48 h。將Matrigel 基質膠按每孔200 μL 加入24 孔板中，使用預冷的槍頭冰上操作。放入37 ℃培養箱包被30 min。將來自不同處理組的細胞消化后計數，每孔按1×105個溶于500 μL 培養基后，覆蓋到24 孔板的Matrigel 上。37 ℃、5% CO2的環境下培養16 h后，使用倒置光學顯微鏡觀察管狀結構，拍攝照片。

HUVEC 攝取Dil‐Ac‐LDL 的功能 分析為了檢測內皮細胞的功能，使用紅色熒光標記的人源乙?；兔芏戎鞍祝℉uman DiI-Ac-LDL）來測量其對低密度脂蛋白（LDL）的攝取。將3×103個細胞鋪在96 孔板中，每孔培養基100 μL，37 ℃、5% CO2的環境下培養24 h。將Human DiI-Ac-LDL 用培養基稀釋至30 μg/mL。 去除初始培養基，將細胞與含Dil-Ac-LDL 的培養基在37 ℃孵育4 h。 除去Dil-Ac-LDL 溶液，PBS 洗滌細胞，在預冷的4% 多聚甲醛溶液中固定20 min。加入適量抗熒光淬滅封片液（含DAPI）孵育10 min。使用熒光顯微鏡觀察并進行拍攝。

qRT‐PCR 檢測使用Trizol 試劑從各組細胞中分離總RNA，promega GoScript RT System 試劑盒將RNA 逆 轉 錄 為cDNA。 使 用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR 系 統 在20 μL 反應體系中進行qRT-PCR：GoScript qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物每條0.4 μL（10 μmol/L），cDNA 模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。反應條件為：95 ℃反應10 min 預變性，95 ℃反應15 s，60 ℃反應1 min，共40 個循環。引物序列見表1。采用ΔΔCt 法檢測各組細胞中基因的表達水平，每組3 個復孔，擴增后目的基因相對表達量=2-（目的基因Ct-內參基因Ct）。

表1 qRT‐PCR 的基因引物序列Tab 1 Prime sequences in qRT‐PCR

統計學方法用SPSS 19.0 統計軟件對數據進行統計分析，采用One-way ANOVA 方法進行檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

HUVEC 和USC 細胞的形態學觀察與鑒定HUVEC 鋪板后第2 天即可出現貼壁細胞團，匯合的內皮細胞出現接觸抑制后，顯微鏡下呈現“鋪路石樣”外觀（圖1A）。選取P2～P5 代進行實驗，傳代后細胞形態無較大改變。從尿液樣品中分離出細胞培養3～5 天，會出現細長的小型細胞團，定時半換液，接觸抑制后細胞呈現梭形外觀（圖1B）。HUVEC 流式檢測顯示99.1%的測試細胞具有CD31表面標記物（圖1C），免疫熒光染色結果顯示胞內標記物vWF 呈陽性（圖1D），該結果證實本次實驗提取的HUVEC 純度高，符合實驗要求。USC 流式檢測結果如下，經檢測USC 表達了間充質干細胞的常見表面標記物，包括CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133，陽性率較高。造血干細胞標記物CD45 表達低。HLA-DR 表達低代表USC的低免疫原性。CD146腎周細胞標記物表達高。符合USC 目前主要的鑒定標準。

圖1 HUVEC 和USC 細胞形態學觀察與鑒定Fig 1 Observation and identification of HUVEC and USC

USC‐Exo 的觀察與鑒定通過透射電子顯微鏡，觀察負染的USC-Exo 樣本形態。 結果顯示，USC-Exo 是直徑約100 nm 的球形囊泡，大小不均，有完整的膜結構（圖2A）。進一步對分離的USCExo 進行納米顆粒蹤跟分析（圖2B），顯示USC-Exo顆粒的粒徑為（66.66±11.70）nm，符合外泌體的標準。

圖2 USC‐Exo 的電鏡圖片以及粒徑報告Fig 2 Electron micrograph and particle size report of USC‐Exo

CCK‐8測定各組細胞活力用正常（5.5 mmol/L）或高濃度（33 mmol/L）的葡萄糖處理HUVEC，與不同濃度（1×108或1×109個/mL）的USC-Exo 組合。孵育48 h 后測量各組OD 值。與對照組相比，高葡萄糖處理的HUVEC 的OD 值顯著降低（圖3）。此外，1×108個/mL USC-Exo 對正常的HUVEC 沒有顯著的影響，而1×109個/mL USC-Exo 對正常細胞則有一定增殖作用。此外，USC-Exo 顯著逆轉了高葡萄糖對HUVEC 的有害影響，且1×109個/mL 優于1×108個/mL。因此，在后續實驗選擇濃度為1×109個/mL的USC-Exo 作為實驗組。

圖3 CCK‐8 法檢測各組細胞處理后吸光度Fig 3 Cell viability of each group detected by CCK‐8

劃痕實驗觀察各組細胞的遷移功能為了揭示USC-Exo 對HUVEC 遷移能力的影響，我們進行了體外劃痕試驗（圖4A）。結果發現對比正常葡萄糖濃度的培養環境（5.5 mmol/L），高濃度的葡萄糖（33 mmol/L）對內皮細胞遷移有抑制作用，且短時間（4 h、6 h）即可出現差異（圖4B、4C）。 而 在33 mmol/L 葡萄糖的條件下，同時加入USC-Exo 則可逆轉這種現象，促進內皮細胞遷移。

圖4 HUVEC 不同狀態下不同時間點的遷移率Fig 4 The migration rate of HUVEC at different time points in different states

成血管實驗檢測各組細胞功能孵育16 h 后，對照組管腔均勻，血管連接節點多，分支多且長；相比之下，高糖處理組血管形成少，管腔較薄，大且不規則，有較多未連接區域，成血管能力受損；高糖處理同時加入USC-Exo 則逆轉了高糖誘導的這種損傷，形成了較多完整且均勻的管腔，在連接點和分支數上也恢復到了正常水平（圖5）。

圖5 HUVEC 不同狀態下的成血管功能Fig 5 Capillary‐like structure formation in HUVECs under different conditions

檢測LDL 攝取確定內皮細胞功能LDL 攝取是內皮細胞功能的另一個重要表現。通過不同預處理后的各組細胞與Human DiI-Ac-LDL 共孵育，應用免疫熒光法檢測不同組攝取LDL 的情況。所得結果證實了HUVEC 在正常濃度葡萄糖中對LDL 的吸收能力，并在高糖預處理后吸收能力顯著降低。高糖預處理時同時加入USC-Exo 則可以恢復一定的攝取功能，稍弱于對照組（圖6）。

圖6 HUVEC 不同狀態下的攝取LDL 的功能Fig 6 LDL uptake analysis by Dil‐AcLDL assay under different conditions

細胞凋亡和氧化相關mRNA 的表達水平qRT-PCR 結果顯示，與正常對照組相比，33 mmol/L高糖處理后HUVEC 促凋亡因子BAX 表達上調，抗凋亡因子Bcl-2、抗氧化因子SOD2 表達下降。而在高糖處理同時添加USC-Exo，可以使BAX 表達下調，Bcl-2、SOD2 上調（圖7）。表明USC-Exo 具有改善高糖誘導細胞氧化，緩解凋亡的作用。

圖7 qRT‐PCR 分析各組HUVEC 處理后相關基因的mRNA 表達Fig 7 qRT‐PCR analysis of mRNA of related genes in each group after treatment

討論

內皮功能障礙的主要特征為氧化應激和炎癥反應。高糖毒性還會導致細胞活力降低并通過多個信號通路促進內皮細胞的衰老，其潛在機制需要進一步研究。利用干細胞及其相關技術治療糖尿病是近年來大有前景的新方法。 已有多種干細胞[15-17］可在體內或體外生成胰島素，或分化為胰島素分泌細胞，它們為根治胰島素缺乏的糖尿病點燃了希望。而2 型糖尿病患者面臨長期難以逆轉的胰島素抵抗，緩解其血管并發癥完全靠再生療法可能作用有限。干細胞在糖尿病血管損傷的改善以及各類并發癥的治療上均有大量文獻報道。涉及到的干細胞包括多能干細胞[18］、間充質干細胞[19］、脂肪干細胞[20］以及尿源性干細胞等。對各類并發癥均有緩解或改善作用，包括糖尿病腎病[20］、糖尿病傷口遷延不愈[21］、糖尿病引起的腦出血[22］等。細胞間的通訊是各種生理和病理過程所必需的。已有研究[23］證實，干細胞的許多功能是通過外泌體傳遞信息來達成的。外泌體是一種具有包膜的小囊泡，直徑為30～150 nm，可以直接轉移來源于供體細胞，作用于受體細胞的各種生物活性分子，包括mRNA，microRNA 和蛋白質等。在多種疾病中的發生發展以及治療預防中，外泌體具有重要作用，包括促進腫瘤細胞的生長和轉移[24］、減少心肌缺血-再灌注損傷[25］、調節巨噬細胞的表型以促進傷口愈合[26］等。已有研究表明，來自人臍帶間充質干細胞的外泌體[27］和來自脂肪的間充質干細胞條件培養基[28］具有保護內皮細胞或足細胞免受高糖損害的潛力，這可能與外泌體內含的相關生長因子或調控RNA 有關。

我們團隊前期對干細胞及其外泌體在糖尿病性ED 中的應用進行了總結[29］，探討認為糖尿病性ED 治療的關鍵在于恢復海綿體內皮細胞的功能，因此選用血管研究常用的HUVEC 作為造模材料。UCS 來源于泌尿系統[30］，我們在鑒定過程中也發現其同時具有間充質干細胞和腎源細胞的細胞標志物，因此我們認為其修復泌尿系統的內皮損傷可能更具有優勢。在本研究中，我們成功地從人尿液中分離出了USC 并提取純化了其外泌體USC-Exo。除了證明USC-Exo 可以促進HUVEC 的增殖，改善高糖對細胞的增殖抑制之外，還可以增加體外毛細血管網的形成，逆轉高糖下內皮細胞遷移減慢的趨勢。內皮細胞遷移和體外成管的能力在各器官血管新生、傷口愈合等過程中起著重要的作用。這些結果表明USC-Exo 是血管生成的正向調節因子。脂蛋白脂肪酶的活性降低是糖尿病最嚴重的內皮損傷之一，已有研究表明糖尿病患者的胰島素抵抗與它的失活高度相關[31］。 通過實驗我們證明了USC-Exo 通過增加內皮細胞內LDL 的熒光攝取，在高糖條件下對脂蛋白脂肪酶的激活起到了明顯的促進作用。另外從基因表達的層面，USC-Exo 下調了高糖影響下的促凋亡基因BAX，上調了抗氧化基因SOD2 的表達。 從這些結果可以推測USCExo 具有改善糖尿病血管氧化應激的效果。

已有研究表明，外泌體中含有的microRNA 是其具有促進血管增殖的起效物質，例如間充質干細胞分泌的外泌體通過miR-125a 降低血管生成抑制劑4（DLL4）促進內皮細胞血管生成[32］；胚胎干細胞分泌的外泌體通過miR-200a 下調Keap1，激活Nrf2恢復衰老相關的血管生成功能障礙[13］等。 因此USC-Exo 在本研究中的血管修復功能是否也是通過其內富含的某種microRNA 所完成的，后續又影響了下游的哪些調控因子和通路，都需要進一步的探究。課題組期待能夠以現有數據為依據，通過后續研究為糖尿病泌尿生殖相關并發癥的再生治療提供更多實驗依據。

作者貢獻聲明莊靖銘 采集樣本，細胞分離純化鑒定，表型與基因實驗，數據統計與分析，論文撰寫和修訂。高鵬，尹爍 研究構思和設計。吳復躍，侯劍剛 研究設計，數據統計分析指導，論文撰寫和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。