腎移植患者尿小圓上皮細胞陽性指標與BK 病毒尿癥的臨床相關性

許瀚仁 王繼納 楊 橙 張 潮 戎瑞明 朱同玉 許 明△

（1復旦大學附屬中山醫院泌尿外科 上海 200032；2上海市器官移植重點實驗室 上海 200032）

腎移植術后BK 病毒（BK virus，BKV）感染導致的BKV 相關腎病（BKV nephropathy，BKVAN）已成為移植腎功能丟失的重要原因之一[1］。BKV在人群中普遍易感，可潛伏在泌尿系統（尤其是腎小管）上皮細胞中。在免疫抑制狀態，腎移植患者體內潛伏的BKV 被激活并進入腎小管上皮細胞的細胞核內進行復制，大量病毒釋放到尿液中，引起BK 病毒尿癥[2］。BKV 在血液中持續高載量表達可進一步損傷移植腎組織，導致腎小管萎縮和間質纖維化，最終形成BKVAN，而目前臨床上對于BKVAN 尚無確切有效的治療手段。

從BK 病毒尿癥到BKVAN 是一個BKV 感染逐步進展的病程，目前臨床上對BKV 感染進行免疫抑制劑減量干預的時機是BKV 血癥或尿液中BKV-DNA 載量持續升高[3］。研究顯示，BK 病毒尿癥對BKVAN 的陽性預測值為27.3%，而BKV 血癥則為54.5%[4］。雖然BK 病毒尿癥對BKVN 的陽性預測值較BKV 血癥低，然而卻是BKV 在腎移植患者體內開始復制的初始階段，如果能夠在BK 病毒尿癥的階段即予以密切監測甚至及早干預治療，將有助于控制BKV 感染進展到BKVAN。

目前臨床上診斷BK 病毒尿癥主要通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）來檢測尿液中BKV-DNA 的載量，當尿液中BKV-DNA 載量＞107copies/mL 時診斷為BK 病毒尿癥[5］。然而，目前國內絕大多數醫院（包括作者所在的醫院）在臨床上并未常規開展BKV-DNA PCR 檢測的項目，通常是器官移植科室的實驗室或委托院外的檢測公司開展此項檢測業務，因而限制了這項檢測的便利性。因此，如果能夠利用臨床上已經普遍開展的檢測方法及指標來預測BK 病毒尿癥，將有助于BK病毒尿癥的早期診斷及病程監測。

腎小管上皮細胞在BKV 感染時的壞死和凋亡會引起炎癥反應，損傷周圍的正常腎小管上皮細胞并導致其脫落，形成臨床尿常規檢測報告中的尿小圓上皮細胞（small round epithelial cells，SREC）。SREC 細胞核小呈圓形，核膜厚，胞質內常見顆粒，與Decoy 細胞在形態上有明顯差異[6］。 尿液中SREC 的檢測方便易行，可以通過全自動尿沉渣分析儀檢測，目前國內大多數醫院已經在臨床普遍開展，尿常規的項目中已包含SREC 的指標項。臨床使用的尿沉渣分析儀有高度準確性、便利性，可大量篩查疑似患者的尿液標本。正常人的尿液罕見SREC，大量的SREC 常見于急性腎小管壞死和腎小管間質炎癥的患者[7］。此外，腎病綜合征、大量蛋白尿、腎移植術后1 周內或移植腎發生排斥反應，均可在患者的尿液標本中檢測到SREC。腎移植術后1 周內，尿中可出現較多的SREC，隨后可逐漸減少而消失。SREC 還常見于女性月經或是女性正常脫落細胞、尿路感染和腎炎腎損傷情況，主要以排除尿路感染的常見因素為主[8］。

本研究擬通過診斷評價方法探索采用尿常規中的SREC（即脫落的腎小管上皮細胞）指標來預測和輔助診斷腎移植術后BK 病毒尿癥的可行性和準確性，為探索采用臨床上已存在的、簡便易行的方法來診斷、監測腎移植術后BK 病毒尿癥提供新的思路。

資料和方法

臨床資料回顧性分析2017年1月—2019年10月在復旦大學附屬中山醫院接受腎移植及隨訪的152例患者，隨訪截至2020年10月，患者隨訪時間最長為40 個月，最短為12 個月，平均隨訪時間為（18±6）個月。納入標準：（1）行1 次及以上的尿液樣本BKV-DNA 載量PCR 檢測；（2）術后穩定長期門診隨訪、行尿常規檢測。排除標準：（1）年齡超過75歲或小于18歲；（2）移植腎功能喪失或伴有嚴重并發癥。本回顧性臨床研究方案經復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準（編號：B2019-320），所有受檢者均簽署了知情同意書。臨床數據統計中包含腎移植患者的年齡、受者性別、免疫抑制方案、隨訪時間、HLA 匹配、血清肌酐、尿白細胞（urine white blood cells，UWBC）、尿 紅 細 胞（urine red blood cells，URBC）、SREC 陽性指標、SREC 持續陽性時間段。本研究中所有腎移植患者術后均接受鈣調磷酸酶抑制劑+麥考酚鈉/嗎替麥考酚酯+糖皮質激素的三聯免疫抑制方案。

儀器與試劑UF-1000i 全自動尿沉渣分析儀及其配套的試劑和質控品均購自日本希森美康株式 會 社；7500 型 定 量PCR 儀（ 美 國Applied Biosystems 公司）；BKV 核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司）；OLYMPUS CKX31 倒置顯微鏡、OLYMPUS FLUOVIEW FV3000 激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；anti-BKV VP1（MAB3204-M02，一抗，亞諾法生技股份有限公司）；重組人細胞角蛋白18（Cytokeratin 18 antibody，CK18，ab668，一 抗），DyLight 488 Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（二抗），山羊抗小鼠IgG H&L（Cy3 ）（二抗，艾博抗上海貿易有限公司）；DAPI 染色液（上海睿寶和生物科技有限公司）；尿沉渣染色液（S-M 方法，珠海貝索生物技術有限公司）。

尿液標本收集和實驗室檢查尿液標本留取收集依患者隨診時進行?；颊咭浦残g后1 周、2 周，1、2、3、6、12、18、24 個月常規進行尿常規檢測，以首次BKV-DNA 定量檢測為觀察期間的開始時間，觀察兩組患者在腎移植術后常規隨訪的尿常規化驗單中SREC 陽性指標，出現SREC 指標陽性的起始時間點和結束時間點，并計算出時間段，將持續3 周及以上的持續陽性時間視為SREC 持續陽性時間段。其中有36 名患者在隨訪期間內BKV-DNA 載量＞1.0×107拷貝/mL，即納入BK 病毒尿癥組，101名患者在隨訪期間內BKV-DNA 載量＜1.0×107拷貝/mL，則納入非BK 病毒尿癥組。

尿沉渣涂片及S‐M染色留取腎移植術后BKV 感染患者的晨尿10 mL，1006.3×g離心5 min，取0.1 mL 的尿沉淀成分并均勻涂在防滑玻片，放置到倒置顯微鏡下加入尿沉淀染色液（S-M 染色）后觀察。

尿沉渣免疫熒光染色收集腎移植術后BKVDNA 載量＞1.0×107拷貝/mL 患者的晨尿100 mL，1006.3×g離心10 min，倒出上清液，將底部沉淀物以同樣條件再離心10 min，取0.1 mL 的尿沉淀成分加入4% 多聚甲醛后石蠟包埋切片，使用一抗anti-BKV VP1（1∶300）和一抗CK18（1：300）染色過夜，PBS 洗滌3 次，與適當的二抗IgG H&L（488）（1∶1000）和二抗IgG H&L（Cy3）（1∶1000）在室溫下孵育1 h。PBS 洗滌3 次，將載玻片用抗褪色試劑和DAPI（藍色）固定。

BKV‐DNA實時熒光定量檢測實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測腎移植患者尿液或者血液中BKV-DNA 載量是目前主要診斷BKV 感染的方法[9］。臨床尿液和血漿標本送至荻碩貝肯臨床檢驗實驗室（上海）檢測并出具檢測報告，使用BKV 核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司）檢測尿液中的BKV-DNA載量。 當尿液BKV-DNA 測定值≥1.0×107拷貝/mL 時定義為BK 病毒尿癥，測定值的范圍為2.0×103～5.0×108拷貝/mL，測定值＞5.0×108拷貝/mL 時，等同為5.0×108拷貝/mL。

尿流式細胞結果檢測分析尿液標本留取收集依患者隨診時進行。患者移植術后1 天，1、2、6、9、12、18 周進行常規的尿常規檢測，同時收集患者中段晨尿10 mL 分裝2 管標本，送至中山醫院檢驗科的UF-1000i 全自動尿液有形成分分析儀進行全尿液流式細胞學SREC 細胞定量指標的檢測。觀察兩組患者在腎移植術后常規隨訪的尿常規化驗單中SREC 陽性指標，出現SREC 指標陽性的起始時間點和結束時間點，計算出時間段，將持續3 周及以上的持續陽性時間視為SREC 持續陽性時間段。

統計學方法采用SPSS 22.0 統計分析軟件。計量資料以±s表示，符合正態分布的資料采用t檢驗，偏態分布的資料采用Mann-Whitney U 檢驗，配對四格表數據比較兩者相關性采用Kappa 檢驗。將影響因素和P＜0.05 因素納入Logistic 回歸模型計算預測腎移植術后出現BK 病毒尿癥感染的獨立預測因素，用ROC 曲線評估獨立預測因素對于BK病毒尿癥的診斷效能。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結果

患者的一般臨床資料本研究中BK 病毒尿癥患者與非BK 病毒尿癥患者在年齡、性別、免疫抑制方案、隨訪時間、血清肌酐、尿白細胞和尿紅細胞的差異均無統計學意義，尿小圓上皮細胞陽性及其持續陽性時間段差異有統計學意義（表1）。

表1 腎移植患者病例資料Tab 1 The clinical data of kidney transplant recipients[±s or n（%）］

表1 腎移植患者病例資料Tab 1 The clinical data of kidney transplant recipients[±s or n（%）］

CsA：Cyclosporine A；Tac：Tacrolimus；MMF：Mycophenolate mofetil；Pred：Prednisolone；HLA：Human leukocyte antigen；SREC：Small round epithelial cell；DSRECP：Duration of SREC positivity.

Item Sex（males/females）Age（years）Follow-up duration（years）Scr（μmol/L）Postoperative immune suppressive regimen CsA+MMF+Pred Tac+MMF+Pred HLA match number URBC（+/-）UWBC（+/-）SREC（+/-）DSRECP（+/-）BK Viruria（n=36）25/1143.33±12.402.83±1.20176.63±12.8612（33.3）24（66.6）4（4，4）14/227/2934/234/2 non-BK Viruria（n=166）81/3540.78±11.393.03±1.37170.06±10.6236（31.1）80（68.9）4（4，4）66/5021/9544/7217/99 P 0.9650.4390.8350.3750.7950.2930.4700.230＜0.001＜0.001

SREC 持續陽性時間段預測BK 病毒尿癥從臨床數據分析，SREC 陽性指標與BK 病毒尿癥有明顯相關性，陽性預測值為68.97%，陰性預測值為72.68%；而多次檢測出的SREC 持續陽性時間段與BK 病毒尿癥也有相關性，陽性預測值為94.44%，陰性預測值為85.34%（表2）；單次和多次檢測的SREC 持續陽性時間段與BKV 血癥無明顯特異性，陽性預測值為11.60%，陰性預測值為98.10%。根據SREC 持續陽性時間段的出現與BK 病毒尿癥確診的時間節點進行比較，SREC 持續陽性時間段能提前（1.5±0.5）個月預測BK 病毒尿癥的發生。

表2 BK 病毒尿癥和多種檢測指標的預測效果Tab 2 The correlation between BK viruria and multiple clinical indicators （%）

尿SREC 中BKV 顆粒的鑒定本實驗在BK 病毒尿癥患者尿沉淀涂片直接觀察可見SREC 與Decoy 細胞同時存在，S-M 法染色后細胞形態有明顯的差異（圖1、2）。尿沉淀制成的石蠟切片免疫熒光結果顯示，VP1 僅在SREC 的細胞質和Decoy 細胞的細胞核上表達，證明SREC 有BKV 感染，與Decoy 細胞同為BK 病毒尿癥的診斷依據（圖3）。本研究同時將不同BKV-DNA 載量、SREC 定量值的尿沉淀切片進行免疫熒光染色處理，再用Image J軟件分析圖片，從該結果可推測SREC 的數量是與尿液BKV-DNA 載量呈正比，而當尿液BKV-DNA載量越大，SREC 內存在BKV 顆粒的細胞比例越高（圖4）。

圖1 BK 病毒尿癥患者的尿沉渣細胞涂片（鏡下，40×）Fig 1 Urine sediment cell smear of patients with BK viruria disease（light microscope，40×）

圖3 BK 病毒尿癥患者免疫熒光染色的尿沉渣切片（40×）Fig 3 Immunofluorescence staining for the BK viruria patient’s urine sediments sections（40×）

圖4 不同時間節點BKV‐DNA 載量的BK 病毒尿癥患者免疫熒光染色的尿沉渣切片（5×）Fig 4 Different BKV‐DNA loads of the BK viruria patient’s urine sediments tissue sections at various time points（5×）

尿SREC 持續陽性時間段預測BK 病毒尿癥的Logistic 回歸模型分析考慮到SREC 與尿液中存在的影響因素的相關性，使用URBC、UWBC、SREC 陽性指標和SREC 持續陽性時間段與BK 病毒尿癥作Logistic 回歸分析。結果顯示，BK 病毒尿癥與SREC陽性指標和SREC 持續陽性時間段有明顯相關性，而與URBC 和UWBC 無明顯相關性，這兩項指標對于SREC 和SREC 持續陽性時間段的預測效能沒有影響（表3）。此結果證明SREC 持續陽性時間段與BK病毒尿癥的相關性最佳。SREC 陽性指標同樣與BK病毒尿癥顯著相關。

表3 BK 病毒尿癥相關Logistic 回歸分析Tab 3 Logistic regression analysis of BK viruria

圖2 BK 病毒尿癥患者的尿沉渣涂片（S‐M 法染色，40×）Fig 2 Urine sediment smear of a patient with BK viruria（S‐M method staining，40×）

尿SREC 定量指標與尿液BKV‐DNA 定量指標成正比線性關系將BK 病毒尿癥患者術后1 天，6周、9 周、12 周定期檢測的SREC 定量指標和BKVDNA PCR 定量指標進行長期多次對比觀察，發現在不同患者的相同隨訪周期內，SREC 與BKV 載量存在相似的變化趨勢且成正比關系，SREC 每增加1個/μL，BKV-DNA PCR 定量指標約增加1.1×108拷貝/mL，反之亦然。將SREC 定量指標與當日患者的尿液BKV-DNA 載量做Logistic 線性回歸模型分 析。 117 份SREC 定量 指標中，與BKV-DNA 的載 量 的 線 性 系 數 為1.1×108（95%CI：7.81×107～2.5×108，P=0.0004），由此可知SREC 的定量指標與高BKV-DNA 載量呈正相關。BK 病毒尿癥患者尿液樣本的SREC 定量指標和BKV-DNA 定量PCR 指標能擬合出一趨勢線，此結果證明SREC 的定量指標與BK 病毒尿癥的高BKV-DNA 載量有線性正相關（圖5）。

圖5 小圓上皮細胞定量值與BK 病毒尿癥患者BKV‐DNA載量的Logistic 線性回歸分析Fig 5 Logistic linear regression analysis of SRECs and BKV‐DNA load in patients with BK viruria

尿SREC 持續陽性時間段與BK 病毒尿癥的ROC 曲線本研究的腎移植患者術后發現BK 病毒尿癥的中位數時間在2.5 個月，而BK 病毒尿癥患者在術后（1.0±0.5）個月檢測到SREC 陽性指標，根據SREC 持續陽性時間段的出現與BK 病毒尿癥確診的時間節點進行比較，SREC 持續陽性時間段可能提前（1.0±0.5）個月預測BK 病毒尿癥的發生。

根據Logistic 回歸分析的結果，以SREC 持續陽性時間段來預測BK 病毒尿癥，AUC 為0.872，95%CI：0.77～0.974，cut-off 值為85.5 天，對BK 病毒尿癥有臨床預測價值（圖6）。此結果證明尿SREC持續陽性時間段預測BK 病毒尿癥發生的效能較佳，可很好降低術后BK 相關腎病的發生。

圖6 尿小圓上皮細胞持續陽性時間段預測BK 病 毒尿 癥的ROC 曲 線Fig 6 ROC curve analysis of urine DSRECP for predicting BK viruria infection

討論

BKV 的感染在健康人群中普遍存在，成年人中BKV 血清抗體陽性可達到90%[5］，平時在泌尿系統的腎小管上皮細胞和尿路上皮細胞里休眠潛伏。由于正常人群免疫功能正常，絕大多數被感染者終生不會出現BKV 感染的臨床癥狀。腎移植患者處于免疫抑制狀態，休眠狀態的BKV 可發生復制、增殖，導致BKV 感染。國內文獻報道腎移植術后BK病毒尿癥、BKV 血癥和BKVAN 的發生率分別是45.6%、22.2% 和5.6%[10］。如果可以早期預測及診斷BKV 感染，則可以密切監測并及時進行干預，從而降低BKVAN 的發生率，提高移植腎的長期存活率。

據國外文獻報道，腎移植術后BK 病毒尿癥主要發生在術后1～3月，從BK 病毒尿癥進展至BKV血癥及移植腎損傷有4～12 周的窗口期[11］。國內的報道顯示，腎移植術后BK 病毒尿癥多發生在術后2個月左右[4］。本研究也發現，腎移植患者BK 病毒尿癥主要發生在術后（2.5±0.5）個月，而SREC 持續陽性時間段能提前（1.5±0.5）個月預測病毒的發生。根據2019年版美國移植學會的臨床建議，尿液細胞學檢測只有Decoy 細胞陽性才能診斷為腎移植術后多瘤病毒感染，在腎移植術后每2 周進行一次尿液細胞學檢查Decoy 細胞直到術后3 個月。而對尿BKV-DNA 載量檢測是術后每個月1 次，直到術后9 個月，再每3 個月檢測一次直到術后2年[3］。

通過尿液細胞學檢查尋找Decoy 細胞，需要經驗豐富的技術人員，而且主觀性較強，臨床上應用有較大局限性?；赑CR 方法的尿液BKV-DNA載量檢測是目前臨床常用方法，但是檢測過程相對比較繁瑣，而且大多數醫院未常規開展，對患者而言頻繁檢測也增加了醫療支出。如果能夠利用目前臨床上尿常規檢測項目中的某些指標，來早期預測甚至診斷BK 病毒尿癥，將有助于密切隨訪BKV的感染病程，從而有針對性地指導BKV 血癥和BKVAN 的檢測及監測。SREC 指標在臨床上多出現于腎臟的急性腎小管壞死、腎小管間質炎癥、尿路細菌感染、腎病綜合征和移植腎排斥等，在BKV感染方面未見文獻報道。已有研究證實，潛伏在尿路上皮中的BKV 增殖性感染可導致腎小管上皮細胞核損傷、細胞破碎溶解，細胞內過氧化氫酶釋放過氧化氫氧化各類細胞器碎片[12］，釋放大量炎癥因子導致周圍正常腎小管上皮細胞脫落，進而從尿液中排除。然而，尚未有研究對SREC 與BKV 感染的相關性進行研究和報道。

本研究以醫院檢驗科的尿常規結果為數據，研究全自動尿沉渣檢測儀檢測SREC 指標用于臨床預測BK 病毒尿癥。由于全自動尿沉渣檢測儀可以大量、準確地測出尿液中的細胞指標，而且尿常規項目是腎移植患者術后常規的檢查項目，應用此臨床指標診斷BK 病毒尿癥能提供更加便捷、經濟實惠的無創臨床診斷方案。

我們的研究發現，SREC 陽性指標、定量指標、持續陽性時間段均與BK 病毒尿癥有明顯的相關性。雙重免疫熒光標記法和S-M 尿沉淀染色法同時證明SREC 細胞質內存在BKV 顆粒，且在該細胞核內未發現BKV 顆粒，由此可知SREC 與Decoy 細胞并非相同細胞類型，而且與BK 病毒尿癥有直接相關性。由此可得出：（1）SREC 持續陽性時間段的指標能提前1 個月預測BK 病毒尿癥的發生；（2）如果SREC 陽性指標持續的時間在85 天左右，預測BK 病毒尿癥的效能最佳，陽性預測值為100%；（3）SREC 在BK 病 毒 尿 癥 中 同 樣 感 染BKV，與Decoy 細胞來源自相同的脫落腎小管上皮細胞，可能為潛在的早期Decoy 細胞的形態；（4）即使混雜了與SREC 相關性較高的尿液干擾因素，也不影響SREC 持續陽性時間段對BK 病毒尿癥的診斷效能；（5）SREC 的定量指標與BK 病毒尿癥的BKV 載量有正比關系，此研究結果可進一步探究SREC 指標診斷BK 病毒尿癥的優化方案。

綜上所述，腎移植患者SREC 陽性指標可預測早期BKV 感染的發生，SREC 陽性時間段在預測BK 病毒尿癥方面的準確性更高，可能為本研究中最優化的輔助診斷早期BKV 感染的臨床指標。

本研究結果尚有不足之處，如病例數不足、缺乏前瞻性研究設計、指標的特異性尚未在其他研究中驗證過，仍需進一步深入研究。

作者貢獻聲明許瀚仁 探索研究方向，數據采集，論文撰寫和修訂。 王繼納 論文構思和指導，實驗設計，數據分析。楊橙 實驗設計，實證與驗證數據分析在臨床上的可行性。張潮 數據統計和分析，模型運算，修訂論文。戎瑞明 論文審閱和指導。 朱同玉 論文框架設計，調整研究計劃。許明 論文修訂和終審。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。