長鏈非編碼RNA GAS5 在腫瘤相關巨噬細胞中的調控機制

李琳 李建東 高志康 徐浩 崔艷峰

HCC 是人類最具侵襲性的惡性腫瘤,因為其轉移和復發,被列為癌癥相關死亡的最常見原因之一［1,2］。HCC 是一種與慢性炎癥相關的腫瘤。在HCC 的炎癥微環境中,入侵的炎癥細胞主要是腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)［3］。研究表明,巨噬細胞的去除可以抑制腫瘤的進展和轉移［4-6］。在腫瘤微環境下,研究巨噬細胞在HCC 發生發展中的分子機制［7］,將為靶向治療HCC 提供新的策略。長鏈非編碼RNA(LncRNAs)在癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移和轉移等多種生物學過程中扮演著重要角色［8］,在HCC 的發生發展中起重要作用。GAS5(LncRNA growth arrest-special transcript 5)是GAS 家族的一員。以往的研究表明GAS5 對腫瘤的發生具有抑制作用［9］。但是GAS5 在巨噬細胞中的作用仍未可知。10 號染色體上缺失的PTEN是一種重要的腫瘤抑制因子。有研究表明,GAS5 通過與miR-32-5p、miR-103 或miR-222-3p 的靶結合,促進PTEN 的表達［10-13］。GAS5 通過直接抑制miR-21 的表達,進而下調與腫瘤細胞遷移和侵襲密切相關的基因［14］,即人程序性細胞死亡因子和PTEN的表達下調,最終抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲。因此,本研究通過ELISA 和qRT-PCR 技術,分析GAS5 和PTEN 在TAMs 中的調控機制,探討其在HCC 發生發展中的變化,為揭示HCC 的發病機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 單核巨噬細胞(THP-1)獲自中國科學院細胞庫。所有引物均購自Takara 公司。用于檢測的人肝癌組織及相應癌旁肝組織取自徐州醫科大學附屬醫院肝膽外科手術切除標本。所有患者術前未接受過放療或生物治療等干預措施。取材后放入-80℃冰箱低溫保存。

1.2 培養單核巨噬細胞 THP-1 在RPMI-1640 培養基(Sangon Biotech)中培養,該培養基含10%胎牛血清(FBS,Sangon Biotech)和1%青霉素/鏈霉素。細胞在37℃和5% CO2環境中培養。

1.3 巨噬細胞的極化 取1.2 分離培養處于對數生長期、生長狀態良好的THP-1,按2×104/孔接種于24 孔板共培小室上室中,用不同的處理方法誘導分化成不同類型的巨噬細胞。50 mg/ml 的巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)作用24 h后誘導THP-1分化為M0巨噬細胞；100 ng/ml 脂多糖(LPS)和γ-干擾素(IFN-γ)處理24 h,誘導THP-1 向M1 型巨噬細胞分化。對于M2 型巨噬細胞,THP-1 與白細胞介素-4(IL-4)(20 mg/ml)共孵育24 h。THP-1 在含50% HepG2 細胞上清液和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基中培養7 d,誘導分化為TAMs。

1.4 ELISA 吸取不同類型的巨噬細胞上清液,3000 r/min 離 心10 min,采 用ELISA 檢 測IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-12 表達。操作步驟按ELISA 試劑盒說明書進行。

1.5 qRT-PCR 采用qRT-PCR 檢測GAS5 和PTEN的表達。使用RNA simple 總RNA 試劑盒(Tiangen)提取培養細胞中總RNA。RNA 的純度使用Nano Drop 2000 分光光度計(Thermo Fisher Scientific)進行檢測。用瓊脂糖凝膠電泳法測定RNA 的含量。利用Prime Script TM RT Reagent Kit(Takara) 將RNA轉化為互補DNA。采用SYBR Green PCR Mix 試劑盒(Takara),在ABI7300 序列檢測系統(應用生物系統)上按說明書進行qRT-PCR。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 四種巨噬細胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-10 的表達變化 檢測四種巨噬細胞上清液,結果顯示,相較于M0,M1 中IL-1β、TNF-α、IL-12表達上調,IL-10 表達下降；M2 和TAMs 中IL-10 表達上調,IL-1β、TNF-α、IL-12 表達下降,差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 四種巨噬細胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-12 的表達變化

2.2 GAS5 和PTEN mRNA 在四種巨噬細胞中的表達變化 qRT-PCR 檢測四種巨噬細胞中GAS5 和PTEN mRNA 的表達。結果顯示,相較于M0,GAS5 和PTEN mRNA 在M1 中表達均有不同程度的上調,GAS5 和PTEN mRNA 在M2、TAMs 中表達下降,差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 GAS5 和PTEN mRNA 在巨噬細胞中的表達變化

2.3 GAS5 和PTEN mRNA 在肝癌組織與正常癌旁組織中表達的變化 收集HCC 患者腫瘤組織和正常癌旁組織,qRT-PCR 檢測GAS5 和PTEN mRNA 的表達。結果顯示,與正常癌旁組織相比,肝癌組織的GAS5 和PTEN 表達明顯上調,差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 GAS5 和PTEN mRNA 在肝癌組織與正常癌旁組織中表達的變化

3 討論

HCC 在我國發病率呈逐年上升趨勢,雖然肝癌的基礎和臨床研究不斷取得進展,但大多數患者就診時已是腫瘤晚期,無法獲得較好的治療效果。因此,尋找診斷和判斷預后的腫瘤標志物已經成為提高HCC 診療水平和降低患者復發率的重要方法。

研究發現,腫瘤的誘發常以慢性炎癥為背景,并伴隨免疫細胞(如巨噬細胞、T 淋巴細胞等)通過釋放各種細胞因子直接或間接殺傷靶細胞來發揮促腫瘤或抗腫瘤作用［15,16］。巨噬細胞是高度可塑的細胞,可以在表型上極化為兩個主要細胞群：M1 型巨噬細胞主要表現為殺傷腫瘤,促進炎性反應的活性；而M2 型巨噬細胞主要表現為抗炎癥,促進腫瘤的生長侵襲活性［17,18］。腫瘤周圍的TAMs 往往表現為M2 型,TAMs 通過表達細胞因子和趨化因子抑制腫瘤免疫,從而促進腫瘤的進展［19,20］。本研究發現,TNF-α 和IL-12 在M1 型中高度表達,IL-10 在M2 和TAMs 明顯上調。M0 型為非極化巨噬細胞,各種細胞因子的表達不會像極化巨噬細胞有明顯的偏置。M1 型高表達IL-1β、TNF-α、IL-12,低表達IL-10,表現出明顯的促炎活性；M2 型高表達IL-10,低表達IL-12 和TNF-α,賦予了強大的抗炎特性。TAMs 表現出M2 樣表型。

近年來,眾多研究表明長鏈非編碼RNA GAS5 在HCC 中起到重要的調控作用。有研究發現,GAS5 通過miR-182/ANGPTL1 軸抑制肝癌細胞的轉移［21］。GAS5通過海綿細胞miR-135b 促進RECK 的表達,從而抑制肝癌細胞的侵襲［22］。Corylin 通過抑制GAS5 介導的上皮-間充質轉化來抑制HCC 的進展。通過在Starbase等生物信息學網站的檢索表明,miR-21 是lncRNA GAS5 的結合分子之一,而PTEN 基因是miR-21 的下游抑制靶點之一。Khalid 等［23］的研究證實了PTEN 與肝癌相關,PTEN 可作為病毒誘導肝癌的潛在預后標志物,HRD1 通過抑制PTEN 的表達促進肝癌細胞的增殖。因此,推測lncRNA-GAS5 的抗肝癌細胞侵襲作用可能是通過抑制miR-21/PTEN 軸而實現的。

本研究發現GAS5 在M1 型巨噬細胞中表達上調,在M2 巨噬細胞和TAMs 中表達下調,提示GAS5 在TAMs 中被抑制。癌組織中GAS5 和PTEN 較癌旁組織表達明顯增高,說明GAS5 和PTEN 參與HCC 的發生。由此推測：肝臟發生癌變過程中肝癌細胞與肝癌浸潤的單核/巨噬細胞相互作用,巨噬細胞由腫瘤初期的M1 型進展為后期的M2 型和TAMs,TAMs 募集通過分泌細胞因子促進有絲分裂及血管生成的表達增多,加速肝癌的進程。TAMs 的密度與肝癌患者的生存時間呈負相關,本研究發現肝癌組織的GAS5 和PTEN 表達增加,說明GAS5 可能參與PTEN 在肝癌細胞的過表達,PTEN 作為具有蛋白磷酸酶和脂質磷脂酶活性的抑癌基因,其表達增加用于抵御肝癌細胞的惡性增長,穩定和增強肝癌細胞間粘附,抑制肝癌細胞浸潤和轉移。因此,推測GAS5 在HCC 進展過程中與TAMs 的極化和PTEN 有關,GAS5 可能是肝癌治療的一個新的治療靶點。

有研究發現,PTEN 可通過誘導細胞周期素依賴性激酶抑制劑p21 等的表達,在抑制細胞的遷移、鋪展和局部粘附及抑制腫瘤新生血管形成等諸多機制發揮抑瘤作用［24］。PTEN 多途徑抑制腫瘤的浸潤和轉移,影響患者的預后。那么,GAS5 和PTEN 在不同極化巨噬細胞中對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲有怎樣的調控作用,仍需進一步探討。