CHKA基因沉默對膠質瘤細胞生物學行為的影響及其機制

黃 靈，鄒有瑞，李琢琦，馬 悅，高鑫義，馬 輝

1.寧夏醫科大學臨床醫學院，寧夏 銀川 750004；

2.寧夏醫科大學總醫院神經外科，寧夏 銀川 750004

膠質瘤是常見的中樞神經系統原發性惡腫瘤，占腦部腫瘤的80%［1］。膠質瘤的治療以手術切除后的常規放療或化療為主［2］。經綜合治療后，腫瘤復發率很高，中位復發時間為6.9個月，中位生存期僅15.0個月且治療過程中容易產生藥物抵抗，預后極差［3］。因此，明確膠質瘤的發生、發展機制，尋找有效的治療藥物便成為治療膠質瘤的重點。

膽堿激酶A（choline kinase A，CHKA）是膽堿代謝途徑中的第1個關鍵酶，能夠催化乙醇胺的磷酸化，調節磷脂酰膽堿合成，這對于迅速增長的膠質瘤細胞來說極其重要。此外，在肝癌中，CHKA已經被描述為一個新的致癌基因，可以使人體內正常細胞向腫瘤細胞演變，其特異性抑制劑已被證明具有體外抗增殖和體內抗腫瘤活性［4］。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）轉導信號通路由有磷酸化磷脂酰肌醇3羥基的脂類激酶活性的PI3K及下游的AKT組成。PI3K/AKT信號通路在細胞生長、增殖、分化及凋亡等生理病理學過程中起著極其重要的作用［5-6］，該信號通路的過度激活與多種腫瘤的發生、發展、增殖及轉移等密切相關［7-8］。然而，CHKA是否對PI3K/AKT信號通路具有調節作用，以及他們之間的關系如何，國內外尚未見報道。因此，我們推測CHKA基因可能是通過PI3K/AKT信號轉導通路調控膠質瘤增殖、凋亡及轉移等生物學行為，本研究采用慢病毒干擾技術下調CHKA基因的表達并構建穩定感染的膠質瘤細胞系U87和U251，探討CHKA基因對膠質瘤細胞生物學行為的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人源U87和U251細胞系購自購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，CHKA基因沉默慢病毒及其對照慢病毒購自北京合生基因化學技術有限公司，U87和U251細胞培養液及胎牛血清購自美國Gibco公司；CHKA、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT抗體購自購自英國Abcam公司，兔抗人GAPDH、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗小鼠二抗/山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，細胞凋亡檢測試劑盒、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞凋亡試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白質定量試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，transwellTM小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD Biosciences公司，細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自上海碧云天生物技術有限公司，TRIzol試劑、反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自日本Takara公司，實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 細胞培養

將U87和U251細胞從液氮中取出迅速復蘇后置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37 ℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中培養，待細胞生長至80%左右時進行傳代。

1.3 慢病毒轉染及分組

按照慢病毒使用說明書將處于對數生長期的U87和U251細胞按3×105個/孔接種于6 孔板中，待細胞貼壁后分別加入用基礎培養基DMEM稀釋后的CHKA沉默慢病毒（shCHKA）及其對照慢病毒（shNC）。培養12 h后，更換普通培養基DMEM，繼續培養12 h后，用熒光顯微鏡觀察細胞轉染情況：若轉染率大于80%，則可繼續培養并進行后續實驗；若轉染率小于80%，則需要加入2 μL/mL嘌呤霉素對細胞進行篩選，收集各組細胞進行之后的實驗。

1.4 RTFQ-PCR檢測膠質瘤細胞中CHKA mRNA的表達

將各組細胞用胰酶將貼壁細胞消化脫壁并置于15 mL離心管內，用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗2遍，棄上清液。向每管中加入TRIzol從1 mL提取總RNA，并測定各組總RNA的濃度及純度，將已經提取的總RNA按照試劑盒中的操作步驟反轉錄cDNA。然后進行RTFQ-PCR檢測各組細胞中CHKA mRNA的表達水平。目的基因CHKA上游引物序列為5′-CGGAAAGTGCTCCTGCGGCT-3′，下游引物序列為5′-AACCAAGCTGTGCAGCCCAA-3′。GAPDH引物序列為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。RTFQPCR反應體系：無酶水6 μL，dNTPs 10 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2 μL（10 ng），ROX 0.4 μL，終體積為20 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，80 ℃延伸60 s，共45個循環；60 ℃終延伸10 min。按照說明書給出的加樣體系加入樣本并上機檢測。采用2-△△Ct法，以GAPDH作為內參計算CHKA mRNA的表達水平。

1.5 CCK-8法檢測細胞的增殖能力

將各組細胞用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化脫壁，保證細胞狀態良好，用培養基稀釋至細胞數為2×104個/mL。每組設置3個復孔，向每孔中加入100 mL細胞懸液，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的恒溫濕式培養箱培養貼壁，然后分別在0、24、48和72 h時向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，繼續培養2 h。用酶標儀測出各孔在不同時間點的450 nm處的吸光度（D）值，依D值的大小判斷細胞增殖情況進行數據分析。

1.6 流式細胞術檢測U87和U251細胞凋亡及周期

1.6.1 細胞凋亡

將各組細胞以3×105個/mL的密度接種至6孔板中，培養12 h后，將各組細胞用不含EDTA的胰酶消化成為單細胞懸液，收集細胞，用PBS以1 000 r/min離心2 min并洗滌2遍棄上清液，再在每組中加上5 μL Annexin Ⅴ-PE和10 μL 7-AAD輕柔混勻后置于冰浴中，用流式細胞儀上機檢測并分析。

1.6.2 細胞周期

將各組細胞以3×106個/mL的密度接種至6孔板中，培養12 h后，將各組細胞用不含EDTA的胰酶消化成為單細胞懸液，收集細胞。向每管中加入約0.5 mL預冷染色緩沖液，重懸細胞并重復1次。1 000 r/min離心3～5 min。棄上清液，加入0.5 mL培養基重懸細胞。用1 mL的移液器吸嘴反復吸取混勻細胞避免成團。最后向各組細胞中加入4 μL的RedNucleus Ⅰ染色液，緩慢并充分混勻，在避光常溫條件下溫育20 min后上機分析。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

將無菌transwell小室取出置于24孔板中。用Matrigel基質膠按1∶9比例稀釋后，取50 μL Matrigel基質膠加入transwell鋪于小室內。置于4 ℃冰箱中風干過夜，第2天用槍頭吸干析出水化培養基。取200 μL 2×105個/mL的細胞懸液于小室上室，下室中加入常規培養基500 mL，繼續培養24 h。用棉簽擦去小室上層細胞，向每孔中加入4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.1%結晶紫溶液染色20 min，取出風干后，用倒置顯微鏡觀察不同視野游下細胞數并計數。

1.8 劃痕實驗

將shCHKA組、shNC組和control組的U87和U251細胞，按照5×105個/孔種植到6孔板中。培養24 h后用1 mL移液器吸嘴垂直于6孔板的底部劃線并用PBS洗掉脫落的細胞。用倒置顯微鏡在0和24 h時觀察其劃痕的寬度并計算劃痕的面積，統計在24 h內劃痕向內遷移的距離。

1.9 蛋白質印跡法（Western blot）檢測細胞中CHKA及PI3K/AKT信號轉導通路相關蛋白的水平

將各組細胞分別提取總蛋白并用BCA法檢測蛋白濃度。以10 μg/孔的上樣量進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），結束后將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜上，膜封閉2 h。吐溫-磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline-Tween，PBST）洗3遍，按照不同相對分子質量的蛋白分別加入CHKA、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT（1∶2 000）抗體并在4 ℃過夜。第2天PBST洗膜2～3次后加入相應種屬的二抗（1∶5 000），室溫溫育1 h，PBST洗膜3遍，加入ECL顯色液顯影，采用Image J軟件檢測并分析條帶灰度值。

1.10 統計學處理

應用GraphPad Prism 8軟件對數據進行分析和作圖。計量資料用表示，組間比較用單因素方差分析，多重比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CHKA轉染效率及CHKA mRNA的表達和蛋白水平

在U87和U251細胞中構建CHKA基因敲除的細胞模型，通過RTFQ-PCR檢測轉染效率（圖1）。shCHKA組U87和U251細胞中CHKA mRNA的表達水平比shNC組和control組顯著降低（U87：t=65.58，P＜0.05；U251：t=24.65，P＜0.001，圖1B、1C）。與control組和shNC組相比，shCHKA組的U87和U251細胞的CHKA蛋白相對表達水平均顯著降低（U87：t=24.72，P＜0.01；U251：t=21.32，P＜0.01，圖1D、1E），說明成功構建了下調CHKA表達的膠質瘤U87和U251細胞株。

圖1 U87和U251細胞中CHKA mRNA表達及蛋白水平Fig.1 mRNA expression and protein level of CHKA in U87 and U251 cells

2.2 下調CHKA對U87和U251細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗結果提示，shCHKA組U87和U251細胞在24、48和72 h的增殖能力均低于control組和shNC組（P＜0.05，圖2）

圖2 CCK-8檢測轉染shCHKA對U87和U251細胞增殖能力的影響Fig.2 CCK-8 assay for assessing the effect of CHKA on

2.3 下調CHKA基因對U87和U251細胞凋亡及周期的影響

采用流式細胞術分析下調CHKA基因對U87和U251細胞凋亡及周期的影響，結果顯示，下調CHKA基因后，U87和U251細胞凋亡比例顯著提高（P均＜0.05，圖3），并將細胞生長阻滯于G2期（P均＜0.05，圖4)。

圖3 流式細胞術檢測轉染CHKA基因對U87和U251細胞凋亡的影響Fig.3 The effect of transfection of CHKA gene on apoptosis of U87 and U251 cells detected by flow cytometry

圖4 下調CHKA基因對U87和U251細胞周期的影響Fig.4 Effect of CHKA gene downregulation on the U87 and U251 cell cycle

2.4 CHKA基因及PI3K/AKT蛋白的表達下調對U87和U251細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結果顯示，轉染shCHKA抑制U87和U251細胞侵襲能力（P均＜0.05，圖5）。

圖5 轉染shCHKA抑制U87和U251細胞侵襲能力Fig.5 The inhibited invasive abilities of U87 and U251 cells after transfection of shCHKA

2.5 CHKA沉默后細胞遷移能力明顯降低

劃痕實驗結果顯示，下調CHKA的表達能抑制U87和U251細胞遷移能力（P均＜0.05，圖6）。

圖6 抑制shCHKA轉染對U87和U251細胞遷移能力的影響Fig.6 The inhibited migration of U87 and U251 cells after transfection of shCHKA

2.6 CHKA下調抑制PI3K/Akt信號轉導通路并調節下游靶蛋白的表達

Western blot實驗結果顯示，與control組及shNC組相比，shCHKA組的p-PI3K和p-AKT蛋白的表達水平與CHKA的表達水平同步降低（P＜0.05），PI3K和AKT表達無明顯影響。在LY294002組中CHKA的表達量卻不受信號轉導通路抑制劑LY294002的影響（P＞0.05），說明下調CHKA表達可以明顯抑制膠質瘤細胞中PI3K/AKT信號轉導通路的激活，但PI3K/AKT信號轉導通路的抑制并不影響CHKA的表達，提示CHKA可能單向調控PI3K/AKT信號轉導通路（圖7）。

圖7 沉默CHKA基因對PI3K/AKT信號轉導通路中蛋白水平的影響Fig.7 Effect of silencing CHKA gene on protein level in PI3K/AKT signal transduction pathway

3 討 論

CHKA是一種將膽堿轉化為磷脂酰膽堿的關鍵酶，該酶在腫瘤中的作用及其致癌過程已被廣泛研究［9］。CHKA在卵巢癌、肺癌、肝癌和乳腺癌等腫瘤的發生、發展過程中起著重要作用，且與這些腫瘤的發展及預后密切相關［10］。本課題組前期的研究［11］顯示，CHKA在膠質瘤中主要作為致癌因子，在不同級別的膠質瘤中的表達有明顯差異，且有研究［12］發現，CHKA的高表達與該疾病的不良預后有關，其原因可能是CHKA的高表達促進了相關癌基因及相關產物的高表達，進而誘導或促進膠質瘤形成，如促進PI3K/AKT信號轉導通路中相關蛋白的表達。

有研究［13］表明，多體素1H-MRS參數膽堿/肌酸（Cho/Cr）代謝差異在不同級別的腦膠質瘤細胞或膠質瘤干細胞中存在顯著差異，因此，Cho/Cr值可作為影像學中診斷膠質瘤及判斷膠質瘤分界的標志，可為膠質瘤的手術切除治療提供有力的參考依據。膠質瘤細胞中CHKA作為膽堿代謝中的第一個關鍵酶，在代謝中起著至關重要的作用。本研究發現，CHKA與PI3K/AKT信號轉導通路與膠質瘤的發展及生物學功能密切相關，在下調CHKA基因表達時能誘導膠質瘤細胞的凋亡，抑制細胞遷移和侵襲，使細胞周期主要停滯在G2期，從而抑制腫瘤細胞增殖。Western blot檢測CHKA及PI3K/AKT信號轉導通路關鍵蛋白的表達水平發現，當下調CHKA后U87和U251細胞中的p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平降低，該結果與已有研究［14-17］的結果一致，提示CHKA可能通過PI3K/AKT信號轉導通路調控膠質瘤的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學功能。在使用PI3K/AKT信號轉導通路抑制劑抑制PI3K/AKT信號轉導通路相關蛋白的表達時，Western blot結果顯示，CHKA表達水平與其他對照組中的結果無差異，提示PI3K/AKT信號轉導通路抑制劑并不能抑制CHKA蛋白的表達，但抑制CHKA的表達卻能夠抑制PI3K/AKT信號轉導通路的活性，說明CHKA可能是通過PI3K/AKT信號轉導通路發揮作用且是單向調控。

綜上所述，下調CHKA基因的表達可有效地抑制膠質瘤細胞增殖、遷移并誘導細胞凋亡，其分子機制可能是通過調控PI3K/AKT信號轉導通路實現的，這些分子及相互作用的發現，為今后腦膠質瘤的臨床治療提供了必要的理論基礎。