血清MIP-1α、S-TK1對于甲狀腺癌術后放射性131I治療效果評估的臨床價值

武鴻文，梅 艷，王 喬，袁 佳，趙立威

四川省腫瘤醫院核醫學科，四川 成都 610041

甲狀腺結節是人體常見的一種內分泌疾病，若不積極干預可發展為甲狀腺癌。甲狀腺癌作為人體內分泌系統較常見的惡性腫瘤之一，發病率雖只占惡性腫瘤1%左右，但近年來甲狀腺癌發病率呈明顯上升趨勢［1］。甲狀腺癌患者主要臨床表現包括甲狀腺占位或頸部淋巴結腫大、吞咽困難、聲音嘶啞等［2］。因此，盡早診斷甲狀腺癌對于患者治療方案的選擇及預后具有重要意義。血清胸苷激酶1（serum-thymidine kinase 1，S-TK1）是新發現的一種腫瘤血清標志物，在診斷腫瘤良惡性方面具有較高的診斷價值，有研究［3］發現，S-TK1表達水平與甲狀腺癌的嚴重程度呈顯著正相關。巨噬細胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）是人體內的一種重要趨化因子，亦稱CC族趨化因子配體3（CC chemokine ligand 3，CCL3），MIP-1α不僅可以促進T淋巴細胞在炎癥部位的聚集，近年來有臨床研究［4］表明，肝癌、乳腺癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤患者血清中MIP-1α呈高表達。因此，S-TK1、MIP-1α可以作為甲狀腺癌患者術前診斷、疾病治療及預后評估的重要血清標志物。本研究通過檢測甲狀腺癌患者血清MIP-1α、S-TK1表達水平，探討兩者表達水平與甲狀腺癌診斷、預后評估及術后療效的相關性，同時對影響患者術后療效的相關影響因素進行分析。

1 資料和方法

1.1 病例資料

選取158例術前疑似甲狀腺癌患者作為研究對象，并以128名健康體檢者作為對照。158例術前疑似患者中共有98例患者根據病理學檢查結果確診為甲狀腺癌，其余60例為良性甲狀腺結節。惡性組女性58例，男性40例；年齡32～72歲，平均（48.58±5.36）歲；良性組女性36例，男性24例；年齡31～74歲，平均（48.36±5.65）歲；對照組女性70例，男性58例；年齡35～74歲，平均（49.05±5.54）歲。對惡性組患者進行清甲治療后，根據全身碘掃描結果分為清甲成功組（58例）和未成功組（40例），并根據患者是否發生轉移分為轉移陽性組20例和轉移陰性組78例。各組患者年齡和性別等差異無統計學意義（P＞0.05）。

納入標準：①所有惡性組患者均符合甲狀腺癌診斷標準［5］，并接受甲狀腺手術切除且于術后擬行首次131I治療；②良性組患者經病理學檢查屬于良性甲狀腺結節；③所有研究對象不存在嚴重心、肝、肺、腎功能不全的情況；④健康對照組為甲狀腺檢查正常且未合并其他重大疾病者；⑤年齡不小于18周歲；⑥均已簽署知情同意書。

排除標準：①合并有橋本甲狀腺炎、甲亢或其他甲狀腺疾病；②臨床資料不完整或未簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集

全面收集所有研究對象的性別、年齡、身高、體重、甲狀腺功能5項、TNM分期、病理學類型及淋巴結轉移等臨床資料。

1.3 全身碘掃描及首次131I清甲療效判定

所有惡性腫瘤患者口服131I 100 mCi 進行治療，1 周后統一使用單光子發射計算機體層成像/計算機體層成像（single photon emission computed tomography/computed tomography，SPECT/CT）進行全身碘掃描（德國Siemens公司，型號：SYMBIA型），采集參數設置：矩陣256×1 024，采集速度為15 cm/min，能峰364 KeV，放大倍數1.0。然后進行斷層顯像采集，采集參數設置：矩陣64×64，能峰364 KeV，窗寬20%，放大倍數1.0。另外使用同機進行CT定位掃描，掃描區域為肋弓至頜下腺水平，電壓、電流分別設置為120 KV、30 mA。最后利用Esoft軟件處理數據得到融和圖像，并由2名工作5年以上的副主任醫師進行閱片，得出掃描結論。

⑴ 第一次清甲成功標準［6］：首次131I清甲治療后1周對所有研究對象進行全身碘掃描及局部斷層融合顯像檢查，結果顯示，甲狀腺床部位無殘留或放射性濃聚及甲狀腺組織。

⑵ 淋巴結及肺轉移判斷標準［6］：治療期間，影像學檢查如B超、CT或正電子發射計算機體層顯像（positron emission tomography and computed tomography，PET/CT）提示存在肺、淋巴結或骨轉移和（或）兩次131I全身碘掃描過程中發現患者肺、淋巴結或骨等甲狀腺外組織攝取131I。

1.4 血清MIP-1α、S-TK1表達水平測定

分別于治療前和治療1周后于清晨采取空腹靜脈血10 mL，3 000 rpm離心10 min后取上清液，采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）檢測所有患者血清MIP-1α、S-TK1表達水平。取240 ng/mL MIP-1α凍干粉，按照1∶20比例將其溶解得到120.000、60.000、30.000、15.000、7.500、3.750、1.875及0.000 ng/mL標準品，在酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）上檢測492 nm處的吸光度（D）值，測定MIP-1α表達水平；另稱取S-TK1溶解，制備8 000、4 000、2 000、1 000、500、250、125及0 pg/mL標準品，并在酶標儀上檢測450 nm處的D值，繪制標準曲線，上述所有操作過程均參照說明書進行，使用酶標儀進行樣品檢測，繪制ELISA標準曲線并根據標準曲線計算各因子濃度。

1.5 惡性組和良性組甲狀腺組織中MIP-1α、S-TK1組織化學染色分析

采用免疫組織化學染色檢測惡性組和良性組MIP-1α、S-TK1在甲狀腺組織中的表達情況。將患者所有組織標本用10%甲醛溶液進行固定及石蠟包埋處理后，4～5 μm切片后進行免疫組織化學染色：先進行石蠟切片，然后進行脫水，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗，使用3%H2O2于室溫下溫育10 min，放于95 ℃的枸櫞酸緩沖液中進行抗原修復，然后加入羊血清于室溫條件下密封1 h，再加入一抗（兔抗），同時使用PBS替代一抗作為陰性對照組，4 ℃溫育過夜后使用PBS沖洗，加入二抗（山羊抗兔）并于室溫條件下溫育45 min；再次使用PBS沖洗并使用二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色和蘇木精復染，然后使用0.1%鹽酸乙醇進行分化和純化水沖洗；將切片脫水后進行透明封固，并在光學顯微鏡下隨機選取5個視野（400倍），統計陽性細胞數量和細胞總數，同時計算陽性細胞率，陽性細胞率分為4個等級：陽性細胞率≤10%為1分，陽性細胞率10%～50%為2分，陽性細胞率50%～75%為3分，陽性細胞率＞75%為4分。

1.6 統計學處理

所有數據均采用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料用表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用單因素和logistic回歸多因素分析患者術后的療效影響因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術前各組研究對象血清MIP-1α、S-TK1表達水平比較

相比健康對照組和良性組，惡性組患者MIP-1α、S-TK1表達水平顯著更高，良性組MIP-1α、S-TK1表達水平高于健康對照組（P＜0.05，表1）。

表1 術前各組研究對象血清MIP-1α、S-TK1表達水平比較Tab.1 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels in preoperative groups ()

表1 術前各組研究對象血清MIP-1α、S-TK1表達水平比較Tab.1 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels in preoperative groups ()

*:P＜0.05,compared with the healthy control group;#:P＜0.05,compared with the benign group

2.2 惡性組和良性組甲狀腺組織中MIP-1α、S-TK1表達水平

免疫組織化學染色結果顯示，MIP-1α蛋白陽性者染色主要表現為棕黃色顆粒狀，惡性組患者甲狀腺組織中MIP-1α蛋白陽性表達率（70.41%）顯著高于良性組（18.33%），惡性組組織中S-TK1蛋白陽性表達率（68.37%）顯著高于良性組（15.00%），差異均有統計學意義（P均＜0.05）。免疫組織化學染色結果見圖1、2。

圖1 MIP-1α在惡性組和良性組中的免疫組織化學染色Fig.1 Immunohistochemical staining of MIP-1α in malignant group and benign group

圖2 S-TK1在惡性組和良性組中的免疫組織化學染色Fig.2 Immunohistochemical staining of S-TK1 in malignant group and benign group

2.3 各組間血清MIP-1α、S-TK1比較

研究結果顯示，與清甲未成功者相比，術后第2次131I治療前清甲成功組MIP-1α、S-TK1血清表達水平均顯著下降（P＜0.01，表2）。兩次全身碘掃描結果和影像學檢查結果顯示，8例患者發生肺轉移，12例患者發生淋巴結轉移，轉移陽性組患者MIP-1α、S-TK1血清表達水平均顯著高于轉移陰性組（P＜0.01，表3）。

表2 術后兩次131I治療前清甲成功組與未成功組血清MIP-1α、S-TK1表達水平比較Tab.2 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels between the successful group and the unsuccessful group before 131I treatment()

表2 術后兩次131I治療前清甲成功組與未成功組血清MIP-1α、S-TK1表達水平比較Tab.2 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels between the successful group and the unsuccessful group before 131I treatment()

表3 術后兩次131I治療前轉移陽性組與轉移陰性組血清MIP-1α、S-TK1表達水平比較Tab.3 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels between two groups before 131I treatment()

表3 術后兩次131I治療前轉移陽性組與轉移陰性組血清MIP-1α、S-TK1表達水平比較Tab.3 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels between two groups before 131I treatment()

2.4 甲狀腺癌患者術后首次131I清甲療效的影響因素分析

單因素分析結果表明，病灶最大直徑、體重指數（body mass index，BMI）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、MIP-1α及S-TK1表達水平會明顯影響甲狀腺癌患者術后首次131I清甲療效（P＜0.05，表4）。

表4 甲狀腺癌患者術后首次131I清甲療效的影響因素分析Tab.4 Analysis of influencing factors of the first 131I clearing effect in patients with thyroid cancer

2.5 甲狀腺癌患者術后首次131I清甲療效影響因素的logistic回歸分析

分別以清甲療效（賦值：清甲成功=1，清甲未成功=0）為因變量，將病灶最大直徑、BMI、TSH、MIP-1α及S-TK1表達水平作為自變量，采用逐步回歸法進行logistic回歸分析。結果顯示，病灶最大直徑、TSH、MIP-1α及S-TK1表達水平是影響術后首次清甲療效的獨立影響因素（P＜0.05，表5），以上獨立因素分別設為A、B、C、D、E，得到回歸方程為Logit（P）=2.689+3.256A（病灶最大直徑）-1.859B（BMI）-2.235C（TSH）-3.524D（MIP-1α）-2.658E（S-TK1）。

表5 甲狀腺癌患者術后首次131I清甲療效影響因素的logistic回歸分析Tab.5 Logistic regression analysis of influencing factors of 131I clearing effect in patients with thyroid cancer

3 討論

臨床上一般認為甲狀腺結節包括良性病變和惡性病變，惡性甲狀腺結節即甲狀腺癌約占甲狀腺結節的10%左右，屬于一種常見的人體內分泌系統惡性腫瘤。由于惡性和良性甲狀腺結節患者的臨床表現存在一定交叉，故目前臨床上對于惡性和良性甲狀腺結節的診斷和鑒別仍存在一定困難。穿刺活檢作為診斷良惡性甲狀腺結節的金標準，具有準確度高等優點，但作為一種有創性檢查會影響患者的依從性和接受程度，因此，研究甲狀腺結節患者的血清學檢查指標具有重要的臨床意義［7］。胸苷激酶作為嘧啶代謝過程中的一種關鍵酶，包括血清胸苷激酶1（serum-thymidine kinase 1，S-TK1）和S-TK2，其中S-TK1主要存在于細胞S期，具有催化脫氧胸苷轉變為脫氧-1-磷酸胸苷酸的功能，可以為DNA合成提供重要原料［3］。研究［8］證實，S-TK1在人體正常細胞中幾乎不表達，但在惡性腫瘤患者的血清中高表達，并且與癌細胞增殖速度呈顯著正相關。已有研究［9］報道，S-TK1在肝癌、乳腺癌、結腸癌和肺癌等惡性腫瘤患者血清內的表達水平顯著升高。MIP-1α是人體內的一種重要的趨化因子，可以促進T淋巴細胞在炎癥部位的聚集，同時可以趨化一些免疫細胞如自然殺傷細胞、單核細胞進入炎癥部位。近年來有臨床研究［10］表明，肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤患者血清中MIP-1α表達水平顯著高于健康人群（P＜0.05）。有研究［11］顯示，甲狀腺結節患者血清MIP-1α水平與患者甲狀腺惡性程度呈顯著正相關（P＜0.05）。本研究通過對比發現，惡性甲狀腺病變患者MIP-1α、S-TK1血清表達水平顯著高于甲狀腺良性病變患者和健康對照組（P＜0.05）。對惡性病變患者進行清甲治療，結果顯示，術后兩次131I治療前清甲成功組MIP-1α、S-TK1血清表達水平均顯著低于清甲未成功組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。經過兩次全身碘掃描及影像學檢查，有20例患者發生轉移（8例發生肺轉移，12例發生淋巴結轉移），轉移陽性組患者血清MIP-1α、S-TK1表達水平均顯著高于轉移陰性組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。Khan等［12］研究報道，甲狀腺癌患者血清S-TK1、MIP-1α水平顯著升高，且表達水平隨著腫瘤分期升高而升高，與本研究結果具有一致性。這主要是由于S-TKl作為一種在細胞增殖過程中發揮重要作用的活性激酶，當腫瘤細胞發生大量增殖和轉移時，細胞生長、分裂活動更加密集，S-TKl表達水平亦顯著升高［13］。而MIP-1可以趨化單核細胞和活化巨噬細胞，釋放出的大量溶菌酶會使患者免疫功能嚴重受損，而腫瘤作為正常細胞發生惡變后的產物，同時會表達正常細胞不表達的一些抗原，機體免疫系統識別腫瘤抗原后會將機體免疫反應激活，因此腫瘤作為一種廣義免疫性疾病，惡性腫瘤發生轉移和擴散后，患者組織中MIP-1α表達水平也會相應升高［14］。趙江花等［15］研究顯示，甲狀腺濾泡上皮細胞質中大量表達MIP-1β（CCL4）和MIP-1α等抗原抗體反應產物，且上述兩種產物在甲狀腺惡性腫瘤組織中的表達水平顯著高于甲狀腺結節組織。因此，MIP-1α、S-TK1表達水平與甲狀腺患者惡性病變程度呈顯著相關性，兩者表達水平可以作為甲狀腺結節良惡性病變早期診斷和術后療效評價的重要血清學指標。

本研究對其他影響甲狀腺癌患者術后療效的相關因素進行分析，單因素分析結果表明，病灶最大直徑、BMI、TSH、MIP-1α及S-TK1表達水平會明顯影響甲狀腺癌患者術后首次131I清甲療效（P＜0.05）。多因素分析顯示，TSH水平、病灶最大直徑、TSH、MIP-1α及S-TK1是影響術后首次清甲療效的獨立影響因素（P＜0.05）。臨床普遍認為較高的TSH有助于殘留甲狀腺組織對碘進行充分攝取，本研究中60～90 μU/mL TSH的患者具有最高的清甲成功率，可能是因為TSH過高導致TSH受體飽和，從而進一步影響碘攝取作用的限制程度。本研究發現，較大病灶的最大直徑清甲療效更佳，主要是由于病灶最大直徑≤1 cm的甲狀腺乳頭狀微小癌一般發展非常緩慢且危害很小，因此，甲狀腺切除手術時清掃程度和清掃范圍也相應縮小，相對殘留的甲狀腺體較多會進一步影響患者清甲成功率［16］。最近有研究［17］顯示，肥胖或高BMI會增加甲狀腺癌的患病風險并影響甲狀腺癌患者的預后，可能是因為胰島素樣生長因子1、脂肪因子及TSH等多種激素之間存在相互作用。Parascandolo等［18］研究報道，BMI增加會導致TSH升高和總三碘甲狀腺原氨酸水平下降，從而激活cAMP/PI3K及RAS-BRAF信號轉導通路，導致腫瘤細胞發生快速增殖。宋韞韜等［19］研究表明，BMI越高，患者的腫瘤病灶范圍一般越廣，因此更容易出現腺外侵犯，從而導致腫瘤轉移和腫瘤分期升高。

綜上所述，甲狀腺癌患者血清MIP-1α、S-TK1表達水平顯著高于健康人群，且病灶最大直徑、TSH、MIP-1α及S-TK1表達水平是影響術后首次清甲療效的獨立影響因素（P＜0.05），MIP-1α及S-TK1表達水平與甲狀腺癌患者術后療效及是否轉移密切相關。